快速PCR方法在哈蟆油真伪鉴别中的应用研究(1)
[摘要] 该研究依据哈蟆油Cyt b基因155位SNP位点设计位点特异性PCR引物，采用碱裂解法提取基因组DNA，2步循环 PCR 程序进行 PCR 反应，并对PCR反应条件进行优化，从而建立起一种哈蟆油及其4种常见混伪品的快速PCR鉴别方法。该方法在90 ℃变性3 s，62 ℃退火延伸20 s进行32个循环时，加入2 μL 100×SYBR Green Ⅰ染料，正品显示出明亮绿色荧光，而混淆品不显示荧光。该方法准确、简便，40 min内即可完成鉴别，为哈蟆油药材现场快速鉴定提供技术支持。
[关键词] 快速PCR；哈蟆油；分子鉴定；荧光检测
[Abstract] Rapid allele-specific PCR primer was designed base on Cytb 155 A/T single nucleotide polymorphism， DNA was extracted by alkaline lysis and the PCR reaction systems including denatured and annealing temperature and cycle numbers were optimized. The results were performed to authenticate Ranae Oviductus and its 4 adulterants. When 100×SYBR Green I was added in the PCR product at 90 ℃ denatured 3 s， 62 ℃ annealing 20 s and 32 cycle. Ranae Oviductus visualized strong green fluorescence under 365 nm UV lamp whereas adulterants appeared negative. The whole process can be completed in 40 minutes.The established method provides the technical support for authentication of the Ranae Oviductus.
, 百拇医药
[Key words] rapid PCR；Ranae Oviductus；molecular authentication
哈蟆油Ranae Oviductus为蛙科动物中国林蛙Rana temporaria chensinensis David雌蛙的輸卵管，经采制干燥而得。具有补肾益精，养阴润肺的功效，用于病后体弱，神疲乏力，心悸失眠，盗汗，痨嗽咳血[1]。是一种集食用药用于一身的名贵中药材。由于多方面原因导致哈蟆油严重的供不应求，致使伪品充斥于市。目前市场上的伪品哈蟆油主要有黑龙江林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油 4类，其他伪品类型少见[2-3]。2015年版《中国药典》规定哈蟆油的鉴别方法为性状鉴定、高效液相色谱法鉴定及膨胀度测定法，但这些方法易受人为因素、环境条件或药材本身的限制，实践中哈蟆油的鉴定仍感到十分困难。
随着分子生药学的发展，分子鉴定技术在哈蟆油药材的鉴别中得到不断的应用[3-6]，很大程度上弥补了传统鉴别方法的不足。但是，已建立的哈蟆油分子鉴别方法，从模板的提取、PCR 反应到最终结果分析，单个样品的鉴定步骤繁琐，耗时长，且需要电泳检测或序列分析比对，不利于现场快速鉴别的使用。
, http://www.100md.com
近年来，快速PCR方法已成功用于金银花[7]，蛇类[8]，太子参[9]，人参、西洋参[10]等中药材的真伪鉴别，因此本项研究基于快速PCR方法对哈蟆油及其常见混伪品(黑龙江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油)进行鉴别研究，有效的提高哈蟆油鉴别反应效率，为哈蟆油药材的鉴别提供更加符合实际需要、简便快捷的方法。
1 材料与仪器
1.1 药材 收集不同产地中国林蛙10批、黑龙江林蛙4批、黑斑蛙4批、中华大蟾蜍4批、牛蛙2批，哈蟆油3批，牛蛙油1批。所有基原动物按传统加工方法分别制成哈蟆油、黑龙江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油，另选取哈蟆油药材3批进行快速PCR方法研究。样品分别采自吉林、黑龙江、辽宁、内蒙古、山东、江苏、湖南、四川等地。经黑龙江中医药大学中药资源与开发教研室王振月教授鉴定，凭证标本保存于哈尔滨市食品药品检验检测中心，见表1。
1.2 仪器 S1000型梯度PCR仪(Bio-rad公司)；ETC811型PCR仪(东胜兴业科学仪器有限公司)；22R型高速冷冻微量离心机(Beckman公司)；ZH-2型漩涡震荡器(天津药典标准仪器厂)；MM400型球磨机(Retsch公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)；310型凝胶成像系统(UVP公司)，2000C型分光光度计(NanoDrop公司)。
, http://www.100md.com
1.3 试剂 琼脂糖(西班牙 Biowest Agarose)；GelRed购自 Biotium 公司；SpeedStar HS Taq DNA 聚合酶、rTaq DNA 聚合酶、DL 2000 DNAMarker 购自 TaKaRa 公司；Transfast Taq DNA 聚合酶购自Transgen公司，Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚合酶购自 Vazyme公司；SYBR Green Ⅰ购自 Invitrogen 公司；其他试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 基因组DNA提取及检测 称取10 mg研磨好的药材粉末，使用碱裂解法[11]提取总DNA，采用10%的Chelex-100进行纯化，并用超微量分光光度计检测DNA的浓度及纯度。取不同样品DNA，分别将浓度稀释为20 mg·L-1用于PCR反应。选择通用引物mcb398，mcb869[12]对哈蟆油及其混伪品样品进行扩增。引物序列及扩增程序见表2。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察并记录，并对PCR产物进行双向测序。, http://www.100md.com(何志一 唐先明 刘建辉 袁媛 蒋超 赵玉洋 王洋)
[关键词] 快速PCR；哈蟆油；分子鉴定；荧光检测
[Abstract] Rapid allele-specific PCR primer was designed base on Cytb 155 A/T single nucleotide polymorphism， DNA was extracted by alkaline lysis and the PCR reaction systems including denatured and annealing temperature and cycle numbers were optimized. The results were performed to authenticate Ranae Oviductus and its 4 adulterants. When 100×SYBR Green I was added in the PCR product at 90 ℃ denatured 3 s， 62 ℃ annealing 20 s and 32 cycle. Ranae Oviductus visualized strong green fluorescence under 365 nm UV lamp whereas adulterants appeared negative. The whole process can be completed in 40 minutes.The established method provides the technical support for authentication of the Ranae Oviductus.
, 百拇医药
[Key words] rapid PCR；Ranae Oviductus；molecular authentication
哈蟆油Ranae Oviductus为蛙科动物中国林蛙Rana temporaria chensinensis David雌蛙的輸卵管，经采制干燥而得。具有补肾益精，养阴润肺的功效，用于病后体弱，神疲乏力，心悸失眠，盗汗，痨嗽咳血[1]。是一种集食用药用于一身的名贵中药材。由于多方面原因导致哈蟆油严重的供不应求，致使伪品充斥于市。目前市场上的伪品哈蟆油主要有黑龙江林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油 4类，其他伪品类型少见[2-3]。2015年版《中国药典》规定哈蟆油的鉴别方法为性状鉴定、高效液相色谱法鉴定及膨胀度测定法，但这些方法易受人为因素、环境条件或药材本身的限制，实践中哈蟆油的鉴定仍感到十分困难。
随着分子生药学的发展，分子鉴定技术在哈蟆油药材的鉴别中得到不断的应用[3-6]，很大程度上弥补了传统鉴别方法的不足。但是，已建立的哈蟆油分子鉴别方法，从模板的提取、PCR 反应到最终结果分析，单个样品的鉴定步骤繁琐，耗时长，且需要电泳检测或序列分析比对，不利于现场快速鉴别的使用。
, http://www.100md.com
近年来，快速PCR方法已成功用于金银花[7]，蛇类[8]，太子参[9]，人参、西洋参[10]等中药材的真伪鉴别，因此本项研究基于快速PCR方法对哈蟆油及其常见混伪品(黑龙江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油)进行鉴别研究，有效的提高哈蟆油鉴别反应效率，为哈蟆油药材的鉴别提供更加符合实际需要、简便快捷的方法。
1 材料与仪器
1.1 药材 收集不同产地中国林蛙10批、黑龙江林蛙4批、黑斑蛙4批、中华大蟾蜍4批、牛蛙2批，哈蟆油3批，牛蛙油1批。所有基原动物按传统加工方法分别制成哈蟆油、黑龙江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油，另选取哈蟆油药材3批进行快速PCR方法研究。样品分别采自吉林、黑龙江、辽宁、内蒙古、山东、江苏、湖南、四川等地。经黑龙江中医药大学中药资源与开发教研室王振月教授鉴定，凭证标本保存于哈尔滨市食品药品检验检测中心，见表1。
1.2 仪器 S1000型梯度PCR仪(Bio-rad公司)；ETC811型PCR仪(东胜兴业科学仪器有限公司)；22R型高速冷冻微量离心机(Beckman公司)；ZH-2型漩涡震荡器(天津药典标准仪器厂)；MM400型球磨机(Retsch公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)；310型凝胶成像系统(UVP公司)，2000C型分光光度计(NanoDrop公司)。
, http://www.100md.com
1.3 试剂 琼脂糖(西班牙 Biowest Agarose)；GelRed购自 Biotium 公司；SpeedStar HS Taq DNA 聚合酶、rTaq DNA 聚合酶、DL 2000 DNAMarker 购自 TaKaRa 公司；Transfast Taq DNA 聚合酶购自Transgen公司，Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚合酶购自 Vazyme公司；SYBR Green Ⅰ购自 Invitrogen 公司；其他试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 基因组DNA提取及检测 称取10 mg研磨好的药材粉末，使用碱裂解法[11]提取总DNA，采用10%的Chelex-100进行纯化，并用超微量分光光度计检测DNA的浓度及纯度。取不同样品DNA，分别将浓度稀释为20 mg·L-1用于PCR反应。选择通用引物mcb398，mcb869[12]对哈蟆油及其混伪品样品进行扩增。引物序列及扩增程序见表2。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察并记录，并对PCR产物进行双向测序。, http://www.100md.com(何志一 唐先明 刘建辉 袁媛 蒋超 赵玉洋 王洋)