金银花配方颗粒的位点特异性PCR鉴别研究(1)
[摘要] 中药配方颗粒已失去所有形态学辨识特征，传统鉴定方法无法有效鉴定其真伪。该文使用位点特异性PCR鉴别技术，根据金银花trnL-trnF的一个SNP位点设计特异性鉴别引物，对金银花基原植物及配方颗粒进行鉴定。经过优化DNA 提取方法后，药材与配方颗粒均成功提取到DNA，金银花基原植物及配方颗粒均可扩增获得约110 bp的条带，混伪品无条带。且BLAST结果比对证明PCR产物序列为金银花trnL-trnF序列。該文研究结果表明，DNA分子鉴定方法可弥补性状、显微鉴别局限性，对中药配方颗粒真实性进行快速准确的鉴定，为其生产、流通、用药安全提供科学依据和保障。
[关键词] 金银花；配方颗粒；位点特异性PCR；分子鉴定
[Abstract] Traditional authentication method is hard to identify herb′s authenticity of traditional Chinese medicine(TCM) formula granules because they have lost all their morphological characteristics. In this study， a new allele-specific PCR method was established for identifying the authentication of Jinyinhua formula granule (made from Lonicerae Japonicae Flos) based on an SNP site in trnL-trnF fragment. Genomic DNA was successfully extracted from Lonicerae Japonicae Flos and its formula granules by using an improved spin column method and then PCR was performed with the designed primer. Approximately 110 bp specific bands was obtained only in the authentic Lonicerae Japonicae Flos and its formula granules， while no bands were found in fake mixed products. In addition， the PCR product sequence was proved from Lonicerae Japonicae Flos trnL-trnF sequence by using BLAST method. Therefore， DNA molecular authentication method could make up the limitations of character identification method and microscopic identification， and quickly identify herb′s authenticity of TCM formula granules， with enormous potential for market supervision and quality control.
, 百拇医药
[Key words] Lonicerae Japonicae Flos；formula granule；allele-specific PCR；molecular authentication
中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，在中医临床配方后，供患者冲服使用的粉状或颗粒状产品。配方颗粒具有携带方便、服用简单、易于调制、适合工业化生产的特点，同时实现了中药同批内产品物质基础的均质性要求，解决了中药长期以来质量不均的问题[1]。自2001年7月，国家食品药品监督管理总局制定了《中药配方颗粒管理暂行规定》规定配方颗粒纳入中药饮片管理范畴以来，中药配方颗粒快速发展，经过10余年的试点，中药配方颗粒已超过600多品种，并广泛应用于600多家医院中[2]。
然而，由于中药配方颗粒已完全失去了传统中药饮片的鉴别特征，其鉴别与监管已成为制约配方颗粒产业的瓶颈问题之一。由于生产、控制工艺的不同，中药配方颗粒一直处于“试点”阶段，尚缺乏统一可控的质量标准，在生产、流通、使用环节上技术监管难度较大[3]，导致中药配方颗粒存在出现以伪充真、以次充好现象的风险，影响配方颗粒的临床功效。
, http://www.100md.com
作为质量控制的上游环节，配方颗粒的基原鉴定直接决定了其质量与疗效。由于配方颗粒系经提取加工形成的颗粒状制剂，已失去所有形态学辨识特征，无法通过性状和显微检测的方式进行鉴别；而在理化鉴别方面目前配方颗粒一般只通过薄层色谱和高效液相色谱进行鉴别，但使用个别指标成分进行定性分析对于近似种、尤其是同属近缘物种的鉴定具有很大困难；且对一些配方颗粒品种，因尚无专属性指标性成分而难以建立化学鉴定方法。因此，目前急需建立准确性高、稳定性好的方法用于配方颗粒原料物种的鉴定。
DNA分子鉴定是指通过比较药材、饮片的DNA差异来鉴别药材、饮片的方法。分子鉴定具有稳定、准确、特异性好、不受生物发展阶段与储藏加工影响等特点，受到了国内外研究者广泛关注，已建立多种中药材及中药饮片的分子鉴定方法[4-11]，甚至也有对中成药乃至其汤剂进行分子鉴定的报道[12-16]。其中蕲蛇、乌梢蛇饮片分子鉴别方法已经作为国家标准率先收录于2010年版《中国药典》中[17]。2016年8月国家药典委员会发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》也明确提出“对于来源复杂的原料药材，必要时采用DNA分子鉴别技术进行物种真伪鉴别”。, http://www.100md.com(蒋超 屠李婵 袁媛 黄璐琦 高伟 金艳)
[关键词] 金银花；配方颗粒；位点特异性PCR；分子鉴定
[Abstract] Traditional authentication method is hard to identify herb′s authenticity of traditional Chinese medicine(TCM) formula granules because they have lost all their morphological characteristics. In this study， a new allele-specific PCR method was established for identifying the authentication of Jinyinhua formula granule (made from Lonicerae Japonicae Flos) based on an SNP site in trnL-trnF fragment. Genomic DNA was successfully extracted from Lonicerae Japonicae Flos and its formula granules by using an improved spin column method and then PCR was performed with the designed primer. Approximately 110 bp specific bands was obtained only in the authentic Lonicerae Japonicae Flos and its formula granules， while no bands were found in fake mixed products. In addition， the PCR product sequence was proved from Lonicerae Japonicae Flos trnL-trnF sequence by using BLAST method. Therefore， DNA molecular authentication method could make up the limitations of character identification method and microscopic identification， and quickly identify herb′s authenticity of TCM formula granules， with enormous potential for market supervision and quality control.
, 百拇医药
[Key words] Lonicerae Japonicae Flos；formula granule；allele-specific PCR；molecular authentication
中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，在中医临床配方后，供患者冲服使用的粉状或颗粒状产品。配方颗粒具有携带方便、服用简单、易于调制、适合工业化生产的特点，同时实现了中药同批内产品物质基础的均质性要求，解决了中药长期以来质量不均的问题[1]。自2001年7月，国家食品药品监督管理总局制定了《中药配方颗粒管理暂行规定》规定配方颗粒纳入中药饮片管理范畴以来，中药配方颗粒快速发展，经过10余年的试点，中药配方颗粒已超过600多品种，并广泛应用于600多家医院中[2]。
然而，由于中药配方颗粒已完全失去了传统中药饮片的鉴别特征，其鉴别与监管已成为制约配方颗粒产业的瓶颈问题之一。由于生产、控制工艺的不同，中药配方颗粒一直处于“试点”阶段，尚缺乏统一可控的质量标准，在生产、流通、使用环节上技术监管难度较大[3]，导致中药配方颗粒存在出现以伪充真、以次充好现象的风险，影响配方颗粒的临床功效。
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作为质量控制的上游环节，配方颗粒的基原鉴定直接决定了其质量与疗效。由于配方颗粒系经提取加工形成的颗粒状制剂，已失去所有形态学辨识特征，无法通过性状和显微检测的方式进行鉴别；而在理化鉴别方面目前配方颗粒一般只通过薄层色谱和高效液相色谱进行鉴别，但使用个别指标成分进行定性分析对于近似种、尤其是同属近缘物种的鉴定具有很大困难；且对一些配方颗粒品种，因尚无专属性指标性成分而难以建立化学鉴定方法。因此，目前急需建立准确性高、稳定性好的方法用于配方颗粒原料物种的鉴定。
DNA分子鉴定是指通过比较药材、饮片的DNA差异来鉴别药材、饮片的方法。分子鉴定具有稳定、准确、特异性好、不受生物发展阶段与储藏加工影响等特点，受到了国内外研究者广泛关注，已建立多种中药材及中药饮片的分子鉴定方法[4-11]，甚至也有对中成药乃至其汤剂进行分子鉴定的报道[12-16]。其中蕲蛇、乌梢蛇饮片分子鉴别方法已经作为国家标准率先收录于2010年版《中国药典》中[17]。2016年8月国家药典委员会发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》也明确提出“对于来源复杂的原料药材，必要时采用DNA分子鉴别技术进行物种真伪鉴别”。, http://www.100md.com(蒋超 屠李婵 袁媛 黄璐琦 高伟 金艳)