在生物体内2，3环氧鲨烯能被不同三萜环合酶环合为齐墩果烷型，乌苏烷型，羽扇豆烷型，达玛烷型和葫芦烷型等多种类型三萜母核[9]。其中葫芦二烯醇合酶(cucurbitadienol synthase，CBS)能催化2，3环氧鲨烯生成葫芦二烯醇，见图1。目前来源于罗汉果[10]、南瓜[11]、黄瓜[12]和药西瓜[13]等葫芦二烯醇合酶已经被成功克隆。为进一步推动葫芦烷型四环三萜生物合成途径解析及高效细胞工厂创建，在本研究中，首先从罗汉果中克隆到葫芦二烯醇合酶(CBS)基因，并将基因转入三萜底盘菌WD2091中实现葫芦二烯醇生物合成途径的异源表达和发酵生产，见图1。在进一步工作中，不同拷贝数质粒调控工程菌中葫芦二烯醇合酶基因表达和高密度发酵等方法被用于提高酿酒酵母细胞工厂中葫芦二烯醇的产量。

    1 材料

    1.1 工具酶与试剂 PrimeSTAR HS DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司和 RNA 反转录试剂盒(Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit)购自大连宝生物工程公司；限制性内切酶SexAI和AscI购自Fermentas公司；质粒小量快速提取试剂盒购自美国Axygen公司；酵母DNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA回收试剂盒购自美国Biomiga公司；氨苄青霉素购自上海生工生物工程有限公司；酵母选择培养基(四缺 ......