1株海绵共生真菌代谢产物的研究(1)
[摘要] 综合运用各种色谱分离技术对海绵共生真菌Emericella variecolor的固体大米培养基发酵产物进行化学成分研究，利用各种波谱技术进行化学结构鉴定。结果从该真菌的发酵产物中分离得到6个单体化合物，分别鉴定为 (+)2acetyldihydroterrein (1)，(+)3acetyldihydroterrein(2)，anditomin(3)，andilesin A(4)，andilesin C(5)，andilesin B(6)。其中化合物1和2为新化合物。
[关键词] 海绵共生真菌； Emericella variecolor； 化学成分
Study on metabolites from a spongederived fungus
LONG Hailin， LI Kangqiang， XU Wendong， FU Yuping*
, 百拇医药
(National Engineer Research Center for the Modernization of Extraction and Separation of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangzhou 510240， China)
[Abstract] We have carried out the investigation on a spongederived fungus，which was identified as Emericella variecolor from the south sea of China. Two new chemical constituents，(+)2acetyldihydroterrein (1) and (+)3acetyldihydroterrein (2)，with four known compounds，anditomin (3)，andilesin A (4)，andilesin C (5) and andilesin B (6)，were isolated from this fungus by column chromatography over silica gel， Sephadex LH20， and ODS. The structures of 1 and 2 were elucidated by spectroscopic methods including NMR，HRESIMS，and CD.
, 百拇医药
[Key words] spongederived fungus； Emericella variecolor； chemical constituents
海洋真菌兼具种属多样、分布广、代谢途经复杂的特性。据统计，已知约71.2万种海洋真菌可栖身诸如水体、底泥、砂石等无机质生境，也可共附生于如藻类、无脊椎动物、鱼类等活体[1]。海绵共生真菌所处的生态环境兼具陆地生态系统无法比拟的高压、高盐、低光照和寡营养的物理胁迫，也存在与其宿主长期协同进化过程中生物选择胁迫，这种胁迫使两者之间发生很多次基因重组或改变[2]，其互扰性和易扰性直接影响它们的次生代谢[34]。迄今为止，国内外学者已从海洋动植物共生真菌中发现一些活性分子，有些具有罕见的结构，如从海绵共附生真菌Penicillium terrestre中发现的胆碱酯酶抑制剂sorbiterrin A[5]，以及从海绵共附生细菌Ruegeria sp.中发现的新颖抗菌环肽类成分[6]等。国内外学者早在二十世纪六七十年代就已经开始对真菌Emericella variecolor进行化学成分研究，发现了多种类型的化合物，如酮类[7]、萜类[89]、多烯吡喃酮類[10]、苯甲醇类[11]等。为了获得更多的活性化合物，本实验采用大米固体培养基进行微生物发酵，在正常室温条件下培养海绵共生真菌Emericella variecolor 30 d，再用乙酸乙酯萃取大米培养基，之后对提取物进行化学成分分离。在提取物中分离得到6个单体化合物，其中化合物1和2为新化合物，其他4个为已知化合物(图1)。
, 百拇医药
1 材料
UV谱用JASCO V550 紫外可见分光光度仪测定；旋光值用Autopol Ⅲ automatic polarimeter型旋光仪测定；HRESIMS用Agilent 1100 series LC/MSD Trap SL型质谱仪测定；NMR用Bruker AvanceⅢ 400 MHz核磁共振仪测定；分析型HPLC用Shimadzu LC20AD 液相色谱仪测定，检测器为SPDM20A；半制备使用Alltech LabAlliance Series Ⅲ仪器，配备UV检测器。
硅胶薄层分析使用青岛海洋化工厂的GF254薄层预制板；柱色谱硅胶(200～300目)为青岛海洋化工厂产品；常压反相ODS柱色谱使用的C18填料为日本YMC公司产品；凝胶柱色谱Sephadex LH20使用的是Pharmacia公司产品；分析用HPLC色谱柱为Thermo Scientific BDS Hypersil的C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；半制备柱为Waters SunfireTM C18柱(10 mm×250 mm，5 μm)；所有试剂为分析纯或色谱纯。
, http://www.100md.com
实验用菌种E. variecolor分离自中国南海采集到的海绵，菌种保藏于北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室。
2 提取与分离
菌株E. variecolor在经过30 d大米培养基发酵后，将大米发酵物充分破碎，用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩后得到粗提物20 g，粗提物用80%甲醇混悬后用石油醚萃取3次，减压回收甲醇水部位得到粗浸膏约10 g。粗浸膏首先用常压ODS柱色谱分离，洗脱剂为30%，40%，50%，60%，70%甲醇梯度洗脱，得到5个流分(Fr.1～Fr.5)。Fr.3(5.2 g)再次进行硅胶 (200～300目，300 g) 柱色谱，以CH2Cl2CH3OH(100∶1，50∶1，30∶1，15∶1，10∶1)梯度洗脱，相同组分合并，得到6个流分(Fr.3.1～Fr.3.6)，其中Fr.3.3为化合物3(1.8 g)，Fr.3.5为化合物4(1.6 g)，Fr.3.1(0.5 g)再经半制备液相 [CH3CNH2O(70∶30)] 色谱分离，得到化合物1(8 mg)和2(10 mg)，Fr.3.4(180 mg)和Fr.3.6(160 mg)分别用半制备液相 [CH3CNH2O(70∶30)] 色谱纯化，分别得到化合物5(52 mg)和化合物6(48 mg)。, 百拇医药(龙海林 李康强 许文东 傅玉萍)
[关键词] 海绵共生真菌； Emericella variecolor； 化学成分
Study on metabolites from a spongederived fungus
LONG Hailin， LI Kangqiang， XU Wendong， FU Yuping*
, 百拇医药
(National Engineer Research Center for the Modernization of Extraction and Separation of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangzhou 510240， China)
[Abstract] We have carried out the investigation on a spongederived fungus，which was identified as Emericella variecolor from the south sea of China. Two new chemical constituents，(+)2acetyldihydroterrein (1) and (+)3acetyldihydroterrein (2)，with four known compounds，anditomin (3)，andilesin A (4)，andilesin C (5) and andilesin B (6)，were isolated from this fungus by column chromatography over silica gel， Sephadex LH20， and ODS. The structures of 1 and 2 were elucidated by spectroscopic methods including NMR，HRESIMS，and CD.
, 百拇医药
[Key words] spongederived fungus； Emericella variecolor； chemical constituents
海洋真菌兼具种属多样、分布广、代谢途经复杂的特性。据统计，已知约71.2万种海洋真菌可栖身诸如水体、底泥、砂石等无机质生境，也可共附生于如藻类、无脊椎动物、鱼类等活体[1]。海绵共生真菌所处的生态环境兼具陆地生态系统无法比拟的高压、高盐、低光照和寡营养的物理胁迫，也存在与其宿主长期协同进化过程中生物选择胁迫，这种胁迫使两者之间发生很多次基因重组或改变[2]，其互扰性和易扰性直接影响它们的次生代谢[34]。迄今为止，国内外学者已从海洋动植物共生真菌中发现一些活性分子，有些具有罕见的结构，如从海绵共附生真菌Penicillium terrestre中发现的胆碱酯酶抑制剂sorbiterrin A[5]，以及从海绵共附生细菌Ruegeria sp.中发现的新颖抗菌环肽类成分[6]等。国内外学者早在二十世纪六七十年代就已经开始对真菌Emericella variecolor进行化学成分研究，发现了多种类型的化合物，如酮类[7]、萜类[89]、多烯吡喃酮類[10]、苯甲醇类[11]等。为了获得更多的活性化合物，本实验采用大米固体培养基进行微生物发酵，在正常室温条件下培养海绵共生真菌Emericella variecolor 30 d，再用乙酸乙酯萃取大米培养基，之后对提取物进行化学成分分离。在提取物中分离得到6个单体化合物，其中化合物1和2为新化合物，其他4个为已知化合物(图1)。
, 百拇医药
1 材料
UV谱用JASCO V550 紫外可见分光光度仪测定；旋光值用Autopol Ⅲ automatic polarimeter型旋光仪测定；HRESIMS用Agilent 1100 series LC/MSD Trap SL型质谱仪测定；NMR用Bruker AvanceⅢ 400 MHz核磁共振仪测定；分析型HPLC用Shimadzu LC20AD 液相色谱仪测定，检测器为SPDM20A；半制备使用Alltech LabAlliance Series Ⅲ仪器，配备UV检测器。
硅胶薄层分析使用青岛海洋化工厂的GF254薄层预制板；柱色谱硅胶(200～300目)为青岛海洋化工厂产品；常压反相ODS柱色谱使用的C18填料为日本YMC公司产品；凝胶柱色谱Sephadex LH20使用的是Pharmacia公司产品；分析用HPLC色谱柱为Thermo Scientific BDS Hypersil的C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；半制备柱为Waters SunfireTM C18柱(10 mm×250 mm，5 μm)；所有试剂为分析纯或色谱纯。
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实验用菌种E. variecolor分离自中国南海采集到的海绵，菌种保藏于北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室。
2 提取与分离
菌株E. variecolor在经过30 d大米培养基发酵后，将大米发酵物充分破碎，用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩后得到粗提物20 g，粗提物用80%甲醇混悬后用石油醚萃取3次，减压回收甲醇水部位得到粗浸膏约10 g。粗浸膏首先用常压ODS柱色谱分离，洗脱剂为30%，40%，50%，60%，70%甲醇梯度洗脱，得到5个流分(Fr.1～Fr.5)。Fr.3(5.2 g)再次进行硅胶 (200～300目，300 g) 柱色谱，以CH2Cl2CH3OH(100∶1，50∶1，30∶1，15∶1，10∶1)梯度洗脱，相同组分合并，得到6个流分(Fr.3.1～Fr.3.6)，其中Fr.3.3为化合物3(1.8 g)，Fr.3.5为化合物4(1.6 g)，Fr.3.1(0.5 g)再经半制备液相 [CH3CNH2O(70∶30)] 色谱分离，得到化合物1(8 mg)和2(10 mg)，Fr.3.4(180 mg)和Fr.3.6(160 mg)分别用半制备液相 [CH3CNH2O(70∶30)] 色谱纯化，分别得到化合物5(52 mg)和化合物6(48 mg)。, 百拇医药(龙海林 李康强 许文东 傅玉萍)