补体抑制活性物质鱼腥草总多糖中内毒素的去除(1)
[摘要] 为建立补体抑制活性鱼腥草总多糖中内毒素的去除方法，将琼脂糖疏水色谱及聚丙烯酰胺凝胶过滤色谱分别与多粘菌素亲和吸附色谱联用纯化鱼腥草多糖。以显色基质比色法检测纯化前后内毒素的含量变化，细胞溶血法检测纯化前后体外抗补体活性变化。结果发现，疏水色谱与亲和吸附色谱的联用对内毒素的清除效果优于凝胶过滤色谱与亲和吸附色谱的联用，其清除率达42.85%。内毒素清除前后，抗补体活性没有明显变化。表明疏水色谱与亲和吸附色谱联用可用于清除鱼腥草总多糖中的内毒素且不影响其抗补体活性。
[关键词] 鱼腥草总多糖； 内毒素； 抗补体； 疏水色谱； 亲和吸附色谱
Removal of lipopolysaccharides from anticomplementary crude
polysaccharides of Houttuynia Herba
, 百拇医药
ZHANG Juanjuan， ZHANG Qinglin， LU Yan*， CHEN Daofeng
(School of Pharmacy， Fudan University， Shanghai 201203， China)
[Abstract] An AffiPrep Polymyxin column was combined with a Phenyl Sepharose column and a Sephacryl S300 column， respectively， to remove the lipopolysaccharides(LPS) in the anticomplementary crude polysaccharides of Houttuynia Herba. The contents of LPS in the polysaccharides were determined by chromogenic tachypleus amebocyte lysate(TAL)method during the procedure of purifying. The anticomplementary activities of the polysaccharides were also compared before and after the removal of LPS. Less remanent LPS was detected after purified using Penyl Sepharose combined with polymyxin column， with the clearance rate of 42.85%. All the columns had no effect on the anticomplementary activity of the polysaccharides. Penyl Sepharose combined with polymyxin column would be sound for LPS removal of the anticomplementary polysaccharides without reducing their bioactivity.
, 百拇医药
[Key words] crude polysaccharides of Herba Houttuynia； LPS； anticomplementary； Penyl Sepharose； polymyxin
魚腥草Houttuynia Herba为三白草科Saururaceae蕺菜属植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鲜全草和干燥的地上部分，具有利尿通淋、抗炎抗过敏、增强机体免疫力等功效[13]。补体系统(complement system)是将对病原体的识别有效地转化为宿主对最初感染发挥防御功能的主要机制之一。补体的过度激活会引起人体免疫系统的过度反应，参与多种疾病的病理过程[4]，临床上目前尚无理想的治疗药物。近年来，本课题组致力于中药补体抑制剂的研究，分离得到了一些高效、低毒的小分子化合物及大分子多糖类天然补体抑制剂[58]。其中，鱼腥草总多糖抗补体活性较强[9]，同时具有显著的解热和防治内毒素(lipopolysaccharides，LPS)诱导的急性肺损伤药效[1011]，临床开发应用前景良好。
, 百拇医药
LPS是革兰阴性细菌的细胞壁外层上的特有结构，在革兰阴性细菌感染与疾病演化中起到重要作用。LPS带有极高的热稳定性，与许多大分子蛋白或多糖类在同一数量级[12]，在提取过程中易被保留于活性总多糖中，不易去除。LPS进入人体内后可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等严重后果[1314]。因此，如何从中药提取物中去除LPS成为医药领域研究的热点。
现常用的LPS清除方法主要有活性炭吸附、微孔滤膜、阴离子交换色谱法、疏水色谱与分子筛法、亲和色谱法、吸附法与相分离法[1618]。但吸附法、化学降解、超滤膜、离子交换色谱等内毒素去除方法的选择性不很高，不适于从一些相对分子质量和分子结构与内毒素十分相近的多糖样品中去除LPS，用于多糖内毒素去除的研究较少[15]。目前内毒素去除的主要侧重点已转移到亲和介质方面，可选用多粘菌素B、组氨酸等作为配基[1920]载于基质上制成相应的亲和介质，该法内毒素去除率高、方法选择性好。本实验通过柱色谱联用去除鱼腥草总多糖中的LPS，以显色基质比色法定量检测内毒素含量，比较疏水色谱与亲和吸附色谱的联用及凝胶过滤色谱与亲和吸附色谱的联用对LPS的清除率，同时比较LPS清除前后鱼腥草总多糖体外补体抑制活性的变化，为中药活性多糖药物中LPS的去除提供方法参考。
1 材料
鱼腥草购买于上海养和堂药业连锁经营有限公司，经复旦大学药学院生药教研室卢燕副教授鉴定为三白草科Saururaceae 蕺菜属植物蕺菜H. cordata的干燥地上部分。鱼腥草总多糖为采用课题组前期优化工艺自制[9]。, 百拇医药(张娟娟 张庆琳 卢燕陈道峰)
[关键词] 鱼腥草总多糖； 内毒素； 抗补体； 疏水色谱； 亲和吸附色谱
Removal of lipopolysaccharides from anticomplementary crude
polysaccharides of Houttuynia Herba
, 百拇医药
ZHANG Juanjuan， ZHANG Qinglin， LU Yan*， CHEN Daofeng
(School of Pharmacy， Fudan University， Shanghai 201203， China)
[Abstract] An AffiPrep Polymyxin column was combined with a Phenyl Sepharose column and a Sephacryl S300 column， respectively， to remove the lipopolysaccharides(LPS) in the anticomplementary crude polysaccharides of Houttuynia Herba. The contents of LPS in the polysaccharides were determined by chromogenic tachypleus amebocyte lysate(TAL)method during the procedure of purifying. The anticomplementary activities of the polysaccharides were also compared before and after the removal of LPS. Less remanent LPS was detected after purified using Penyl Sepharose combined with polymyxin column， with the clearance rate of 42.85%. All the columns had no effect on the anticomplementary activity of the polysaccharides. Penyl Sepharose combined with polymyxin column would be sound for LPS removal of the anticomplementary polysaccharides without reducing their bioactivity.
, 百拇医药
[Key words] crude polysaccharides of Herba Houttuynia； LPS； anticomplementary； Penyl Sepharose； polymyxin
魚腥草Houttuynia Herba为三白草科Saururaceae蕺菜属植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鲜全草和干燥的地上部分，具有利尿通淋、抗炎抗过敏、增强机体免疫力等功效[13]。补体系统(complement system)是将对病原体的识别有效地转化为宿主对最初感染发挥防御功能的主要机制之一。补体的过度激活会引起人体免疫系统的过度反应，参与多种疾病的病理过程[4]，临床上目前尚无理想的治疗药物。近年来，本课题组致力于中药补体抑制剂的研究，分离得到了一些高效、低毒的小分子化合物及大分子多糖类天然补体抑制剂[58]。其中，鱼腥草总多糖抗补体活性较强[9]，同时具有显著的解热和防治内毒素(lipopolysaccharides，LPS)诱导的急性肺损伤药效[1011]，临床开发应用前景良好。
, 百拇医药
LPS是革兰阴性细菌的细胞壁外层上的特有结构，在革兰阴性细菌感染与疾病演化中起到重要作用。LPS带有极高的热稳定性，与许多大分子蛋白或多糖类在同一数量级[12]，在提取过程中易被保留于活性总多糖中，不易去除。LPS进入人体内后可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等严重后果[1314]。因此，如何从中药提取物中去除LPS成为医药领域研究的热点。
现常用的LPS清除方法主要有活性炭吸附、微孔滤膜、阴离子交换色谱法、疏水色谱与分子筛法、亲和色谱法、吸附法与相分离法[1618]。但吸附法、化学降解、超滤膜、离子交换色谱等内毒素去除方法的选择性不很高，不适于从一些相对分子质量和分子结构与内毒素十分相近的多糖样品中去除LPS，用于多糖内毒素去除的研究较少[15]。目前内毒素去除的主要侧重点已转移到亲和介质方面，可选用多粘菌素B、组氨酸等作为配基[1920]载于基质上制成相应的亲和介质，该法内毒素去除率高、方法选择性好。本实验通过柱色谱联用去除鱼腥草总多糖中的LPS，以显色基质比色法定量检测内毒素含量，比较疏水色谱与亲和吸附色谱的联用及凝胶过滤色谱与亲和吸附色谱的联用对LPS的清除率，同时比较LPS清除前后鱼腥草总多糖体外补体抑制活性的变化，为中药活性多糖药物中LPS的去除提供方法参考。
1 材料
鱼腥草购买于上海养和堂药业连锁经营有限公司，经复旦大学药学院生药教研室卢燕副教授鉴定为三白草科Saururaceae 蕺菜属植物蕺菜H. cordata的干燥地上部分。鱼腥草总多糖为采用课题组前期优化工艺自制[9]。, 百拇医药(张娟娟 张庆琳 卢燕陈道峰)