小檗碱对金黄色葡萄球菌诱导的ECV—304细胞凋亡相关基因的影响(2)
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参见附件。
1.2.4 细胞总RNA提取：
采用TRIzol一步法提取细胞总RNA，用DEPC处理水20μl溶解RNA。
1.2.5 反转录及PCR扩增：
按照反转录试剂盒说明书上的操作将提取的总RNA反转录为cDNA，用cDNA作为模板PCR扩增相关基因，基因引物序列及扩增片段大小见表1，引物合成由上海Invitrogen公司完成。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测并在紫外灯下观察拍照。以GAPDH为内参，BandScan软件分析各个条带的光密度值，计算各组细胞因子mRNA表达相对值(目的基因/内参基因)。
1.2.6 WB检测凋亡相关蛋白表达：
每孔加入100μl0.25%胰酶，37℃消化5min后加入1ml完全培养基终止消化，吹下细胞并分别收集于1.5mlEP管，4000rpm5min离心，弃上清收集细胞。加入150μl细胞裂解液及2μlPMSF，于冰上反复吹打2min，将EP管置于冰上，每5min振荡一次共30min使细胞充分裂解，4℃，12000rpm离心15min，上清为总的细胞蛋白溶解成分。按常规方法进行SDS-PAGE，分离胶12%，浓缩胶5%，电泳时间1.5h。350mA恒流电泳90min转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉中4℃封闭过夜，然后用1×TBST漂洗3次，封闭后的膜放入杂交袋中，加入1：200稀释的一抗于袋内，4℃过夜，TBST漂洗3次加PBS1：5000稀释的羊抗兔IgG二抗，置37℃孵育1h，TBST振荡洗膜3次，每次10min。ECL方法显色后用BIO-RAD凝胶成像仪检测蛋白并拍照。以β-actin蛋白为内参，BandScan软件分析条带的光密度值，计算各组细胞因子蛋白的相对表达量(目的蛋白/内参蛋白)。
1.2.7 统计学分析：
所有实验均重复3次，各组数据采用X±s表示，结果用SPSS16.0统计软件中的
2 结果
2 ......
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