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胶原性关节炎大鼠血清中炎性细胞因子的表达

http://www.100md.com 2006年3月1日李兴琴杨德华钱玉中韩彩芝

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    参见附件(163KB，2页)。

     【摘要】目的观察白细胞介素1(IL1β)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素4(IL4)和白细胞介素10(IL10)在Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠血清中的表达。方法健康雄性Wistar大鼠随机分为对照组和模型组，模型组以牛Ⅱ型胶原皮下注射诱导建立胶原性关节炎模型。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定上述细胞因子的含量。结果与正常对照组比较，免疫后7周关节炎大鼠血清IL1β、TNFα含量明显升高(P<0.01)，IL10含量明显降低(P<0.01)，IL4含量虽低于正常对照组，但没有统计学差异(P>0.05)。结论细胞因子网络失衡与胶原性关节炎大鼠的发病相关。

    【关键词】类风湿性关节炎；胶原性关节炎；大鼠/动物模型；细胞因子

    The content of inflammatory cytokines in serum of rats with type Ⅱ collageninduced arthritis

    LI Xingqin,YANG Dehua,QIAN Yuzhong,et al.

    Heibei Center for Disease Prevention and Control，Shijiazhuang 050021

    【Abstract】 Objective To investigate the serum levels of interleukin1β (IL1β),tumor necrosis factorα (TNFα),interleukin4 (IL4) and interleukin10 (IL10) in rats with type Ⅱ collageninduced arthritis.Methods GradeⅡ male Wistar rats were randomly divided into 2 groups,control group and model group.The rat model was established by subcutaneouly injecting bovine nasal cartilage Ⅱ collagen.The serum levels of IL1 β,TNFα,IL4 and IL10 were determined by enzymelinked immunosorbent assay in 2 groups.Results 7 weeks after the immunization,the serum levels of IL1β and TNFα were significantly higher than those of the control group (P<0.01),and the concentration of IL10 was remarkably lower (P<0.01).There was no significant difference in the activity of IL4 between control group and model group (P> 0.05).Conclusion The imbalance of cytokine network relates with the pathogenesis in the rat with collageninduced arthritis.

    【Key words】 rheumatoid arthritis;collageninduced arthritis;rat/animal model;cytokines

    近年来，在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者血清、关节液或滑膜组织中陆续检出的多种细胞因子，构成细胞因子网络，参与RA整个病理过程。细胞因子在RA发病中具有促炎、抑炎或刺激、抑制的正负反馈免疫调节作用[1]。目前，Ⅱ型胶原诱导的大鼠实验性关节炎模型在临床表现、病理组织学及体液免疫反应方面与人RA接近，是研究人类类风湿性关节炎和其他自身免疫性疾病的常用动物模型。本研究以牛Ⅱ型胶原皮下注射诱导建立胶原性关节炎大鼠模型，观察细胞因子网络在其发病中的作用。

     1 材料与方法

    1.1 实验动物清洁级Wistar大鼠60只,雄性,体重(100±20)g,河北省实验动物中心提供,合格证号：DK04110031，适应性饲养1周后用于实验。

    1.2 主要试剂卡介苗冻干粉(60 mg/支)，北京生物制品研究所生产，批号：200406028；牛源性Ⅱ型胶原(10 mg/支)，Chondrex，LLC，Seattle，批号：040307；IL1β、TNFα、IL4、IL10 ELISA检测试剂盒，RapidBio Lab California USA，批号分别为21010533、25100401、06090402、10110402。

    1.3 乳剂配制参见文献[2]，将牛源性Ⅱ型胶原(CⅡ)溶于0.1 mol/L冰醋酸中，浓度为2 mg/ml，在4℃下搅拌使之充分溶解，置于4℃冰箱中过夜。将减毒卡介苗(BCG)80℃灭活，至高压灭菌的液体石蜡中，充分研磨至完全溶解，浓度为10 mg/ml，制成完全佐剂(CFA)。

    1.4 动物分组及造模 60只大鼠随机选出50只以备造模，另外10只作为正常对照。在造模成功的大鼠中再随机选出10只作为模型组，其余另作它用。具体造模如下：将溶解于冰醋酸的CⅡ加入等体积的CFA，在冰浴条件下使二者充分乳化(以乳化液滴入水中不扩散为度)，CⅡ最终浓度为1 mg/ml。在大鼠背部、尾根部多点皮下注射该乳剂，每点0.1～0.2 ml，每只大鼠1.0 ml。初次免疫10 d后加强免疫，在鼠背部、尾根部皮下注射乳剂，每只大鼠1.0 ml(注：尽量避免与初次免疫注射相同位置)。

    1.5 关节炎症程度评判[3] 分别于初次免疫后3、4、7周，采用关节分数评分法记录多发性关节炎病变的发生及严重程度。关节炎症积分(arthritis index，AI)记分标准分5级(0～4)，0级：无红肿；1级：足小趾关节红肿；2级：趾关节、足跖部均红肿；3级：踝关节以下均红肿；4级：包括踝关节，全部红肿，最高为12分。

    1.6 X线影像学观察分别于初次免疫后3、7周，用X线摄片机对大鼠双下肢摄片，摄片条件为63 kV，1.0 s，电流8 mA。

    1.7 细胞因子IL1β、TNFα、IL4、IL10检测分别于初次免疫后3、7周眼底静脉丛采血，离心分离血清，各细胞因子测定严格按ELISA试剂盒说明书操作，用酶标仪测量光密度，计算各细胞因子的血清含量。

    1.8 统计学处理实验数据采用t检验进行统计学处理，以均数±标准差(±s)表示，P<0.05为有统计学意义。

     2 结果

    2.1 大鼠关节炎发病的一般情况初次免疫9～10 d，部分大鼠踝关节皮肤开始发红，轻度肿胀。2周左右，大鼠四肢关节红肿加重，以双侧后足踝关节最为明显，足垫增厚，大鼠活动量减少，食欲下降，皮下注射部位出现多处小溃疡，随后结痂愈合。4周左右大鼠关节炎病变最为严重，活动困难，体重增长缓慢，甚至下降。其后关节肿胀逐渐减退，部分大鼠出现关节强直。关节炎症程度评分见表1。

    表1 两组大鼠炎症指数的比较(略)

    注：与正常对照组比较，*P<0.01

    2.2 大鼠关节炎X线影像学改变正常大鼠关节面清晰,骨质结构完整；关节炎大鼠踝及跖趾关节边缘模糊甚至融合，关节间隙狭窄，软组织肿胀明显，同时新生骨增生明显，足踝关节出现骨关节强直，见图1。

    图1 正常大鼠与模型大鼠关节X线影像学比较(略)

    2.3 大鼠血清IL1β、TNFα、IL4、IL10的含量实验结果表明，初次免疫后3周，关节炎大鼠血清IL1β、TNFα含量与正常对照组比较明显升高(P<0.01)，而IL4、IL10含量虽低于正常对照组，但两组比较没有统计学差异(P>0.05)；初次免疫后7周，关节炎大鼠血清IL1β、TNFα含量与正常对照组比较明显升高(P<0.01)，IL10含量与正常对照组比较明显降低(P<0.01)，IL4含量虽低于正常对照组，但两组比较没有统计学差异(P>0.05)，结果见表2。

    表2 两组大鼠血清IL1β、TNFα、IL4、IL10含量的比较(略)

    注：与正常对照组比较，*P<0.01

     3 讨论

    由Ⅱ型胶原诱导的实验性关节炎动物模型是研究人类类风湿性关节炎的常用模型，报道的复制方法中Ⅱ型胶原的注射剂量在0.5～2 mg/只不等。本实验的预实验和实验结果表明，该模型的发病率与提高Ⅱ型胶原的浓度，即与Ⅱ型胶原的注射剂量相关。炎性细胞因子根据其性质可分为两大类，即促炎细胞因子和抑炎细胞因子。其中常见的促炎细胞因子包括IL1、TNFα，抑炎细胞因子则主要有IL4、IL10等。研究证实，RA患者外周血单核细胞和关节滑膜液的巨噬细胞能分泌IL1和TNFα，使外周血和关节滑膜液中IL1和TNFα增高[4]，它们在关节炎症、骨质破坏等病变发展中起主要作用。IL4和IL10是两种抗炎症的TH2型细胞因子，可下调抗原递呈细胞功能，抑制TH1增生，抑制IL1、TNFα和其他炎症细胞因子的功能和生成，抑制基质金属蛋白酶的生成[5]，从而抑制RA关节炎炎症，控制或阻止软骨及骨的破坏。本实验结果也表明，与正常对照组比较，关节炎大鼠血清IL1β、TNFα含量明显增高，说明IL1β和TNFα这对“姐妹细胞因子”在大鼠关节炎的发病中起着“中心罪犯”的作用。试验证明循环中IL10的水平与炎症程度有密切关系，RA炎症患者血循环中的IL10较正常人明显为低[6]。本实验结果显示，免疫3周的关节炎大鼠血清IL4、IL10含量与正常对照组比较虽降低但没有统计学差异；免疫7周的关节炎大鼠血清IL10含量与正常对照组比较明显降低，说明随着病程的延长，促炎细胞因子和抑炎细胞因子的平衡进一步被打破。总之，在关节炎大鼠发病过程中，细胞因子网络的失调，即促炎细胞因子和抑炎细胞因子的不平衡占有重要地位，这与人RA发病过程的表现一致。

     参考文献

    1 杜彪，周建初，黄素珍类风湿性关节炎的药物治疗进展河北医药，1998，20：356357

    2 金涌,李俊,张运芳,等.阿克他利对Ⅱ型胶原性关节炎小鼠治疗作用及初步机制研究.中国药学杂志,2001,36:814816.

    3 Carter RA,Campbell IK,O’Donnell K，et al.Vascular cell adhesion molecule1 (VCAM1) blockade in collageninduced arthritis reduces joint involvement and alters B cell trafficking.Clin Exp Immunol,2002,128:4451.

    4 Breedveld FC.New insights in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.J Rheum,1998,25:38.

    5 Jossten LAB,Lubberts E.Role of IL4 and IL10 in murine collenageinduced arthritis:protective effect of IL4 and IL10 treatment on cartilage destruction.Arthritis Rheum,1997,40:249.

    6 Yudoh K.Reduced expression of the regulatory CD+4 T Cell subsets related to Th1/Th2 balance and disease severity in rheumatoid arthritis.J Arthritis Rheuma,2000,43:617627.

    作者单位： 050021 石家庄市，河北省疾病预防控制中心(李兴琴、韩彩芝)；河北省中医药研究院(杨德华、钱玉中)

http://www.100md.com/html/paper/1002-7386/2006/03/02.htm

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