清脂益肝汤对非酒精性脂肪肝大鼠治疗的实验研究
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【摘要】 目的 观察清脂益肝汤和二甲双胍治疗脂肪肝大鼠在疗效、生化、病理、脂肪代谢、胰岛素及瘦素基因表达各方面指标的变化。方法 雄性Wistar大鼠43只，按体重层次随机分为4组，对照组(Ⅰ组)10只、模型组(Ⅱ组)11只、清脂益肝汤组(Ⅲ组)11只、二甲双胍组(Ⅳ组)11只，对照组饲以普通鼠饲料，其余三组均饲以高脂饲料。饲养4周后病理证实脂肪肝己形成，随后进行灌胃治疗，Ⅲ组16 g生药·kg-1·d-1,Ⅳ组二甲双胍170 mg·kg-1·d-1，每天一次5 m1灌胃，Ⅰ组及Ⅱ组大鼠灌服等量蒸馏水，各组按原饲料进行饲养。8周后，全部处死，取血及肝组织，测定血中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)、空腹胰岛素(FINS)、空腹血糖(FBS)、游离脂肪酸(FFA),瘦素mRNA(Leptin mRNA)在肝组织内表达，观察肝脏组织学变化。结果 脂肪肝大鼠存在明显脂肪代谢紊乱，肝功能异常，胰岛素抵抗及瘦素mRNA表达增高；清脂益肝汤和二甲双胍能显著改善肝功能、降低血脂、降低瘦素高表达、改善胰岛素抵抗及肝组织学病理。结论 清脂益肝汤和二甲双胍对实验性大鼠脂肪肝有一定治疗效果。
【关键词】 清脂益肝汤：二甲双胍；大鼠；脂肪肝；胰岛素抵抗；瘦素
Study on the therapeutic effects of metformin and Qingzhiyigan decoction on rats with non-alcohol fatty liver
KAN Zhichao，LI Yan，SHAO Hong,et al.
The Third Central Hospital of Tianjin,Tianjn 300170
【Abstract】 Objective To observe the change of the liver function,histology,fatty metabolism,insulin,leptin mRNA and so on，after using metformin and Qingzhiyigan decoction in rats with nonalcohol fatty liver.Methods 43 male Wistar rats were randomly divided into four groups,control group (n=10),model group (n=11),metformin group (n=11),Qingzhiyigan decoction group (n=11).The rats in control group were fed with normal diet,and the rats in other three groups were fed with a high fat diet.After four weeks,fatty liver model was established.The rats in model group,metformin group and Qingzhiyigan decoction group were fed with high fat diet while the rats in control group were fed with normal diet.After eight weeks all the animals were killed.Serum activities of liverassociated enzymes,blood lipids,FFA,leptin mRNA,fasting blood glucose,fasting plasma insulin,HOMA insulin resistance index (HOMAIR) and the liver histology of rats in all groups were detected.Results The serum ALT,AST,TC,TG,HOMAIR,FFA and leptin mRNA in metformin group and Qingzhiyigan decoction group were significantly lower than those in model group.The liver histology in the metformin group and Qingzhiyigan decoction group was improved significantly.Conclusion Qingzhiyigan decoction and metformin may be effective in treating rat fatty liver induced by high fat diet.
【Key words】 Qingzhiyigan decoction;metformin；rats;fatty liver；insulin resistance;leptin
非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一种以无过量饮酒史而肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。经B超检查，脂肪肝的平均人口检出率为10%。在肥胖症和糖尿病患者中占50%。重度肥胖性脂肪肝中约有1/4的患者并存肝纤维化，有1.5%～8.0%患者可能将发生肝硬化[1，2]。但是，由于脂肪肝发病涉及多个环节，现在针对脂肪肝临床上还没有疗效肯定的药物[3]。二甲双胍在国际及国内的多组实验中都证明可以改善NAFLD的肝功能，降低肝内炎症，改善胰岛素抵抗，降低瘦素，改善脂肪肝的肝组织学[4]。清脂益肝汤己在临床使用多年，对患者的症状减轻及肝功能改善均有肯定疗效。本实验旨在进一步研究该中药和二甲双胍对脂肪肝发病各环节的作用及病理学的变化、其作用机制及两者疗效比较。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：雄性Wistar大鼠43只，体重245～340 g，平均(279.65±16.44)g。由天津军事医学研究所实验动物中心提供。
1.1.2 主要仪器：5810R低温离心机、R404A型-86℃低温冰箱、台式低速离心机、高速离心机、全自动生化分析仪、紫外/可见光分光光度仪、PCR扩增仪(FeroTec，中国杭州大和热磁公司)、GIS2010凝胶图像分析仪(中国上海天能科学仪器公司)。
1.1.3 主要试剂：胆固醇购自北京鼎国生物技术发展公司；猪油为市售；FFA、甘油三酯、胆固醇测试试剂盒(南京建成生物工程公司)；ALT、AST试剂盒(上海荣盛生物有限公司)；INS试剂盒(北京北方生物技术研究所)；盐酸二甲双胍(上海施贵宝公司)。研成粉末，双蒸水溶解配成17.0 g/L混悬液。AMV反转录酶、dNTP和脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)(大连宝生物公司)；Taq酶、UNG酶(μracil DNA glycosylase)、超纯水和DNA分子量标准(北京鼎国生物公司)；异硫氰酸胍、焦碳酸二乙酯(DEPC)、湿润剂P40(NP40)和β巯基乙醇(Simga公司)。清脂益肝汤：首乌、黄芪、决明子、柴胡、酒大黄、熟地、当归、山药、川芎、茯苓、赤芍、薏米、茵陈、丹参、泽泻等组成。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与模型建立：43只大鼠在动物房内适应性喂养1周后，随机分为4组：正常对照组(Ⅰ组)10只，模型组(Ⅱ组)11只，清脂益肝汤组(Ⅲ组)11只、二甲双胍组(Ⅳ组)11只。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组饲以高脂饲料，配方为：普通饲料+1%胆固醇+14%猪油，由天津市华容实验动物中心饲料厂配制；正常对照组饲以普通饲料，实验动物自由饮水和进食。4周后随机抽取Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ三组中各一只大鼠脱颈处死，病理证实脂肪肝已形成。清脂益肝汤组给生药16 g·kg-1·d-1，灌胃治疗；二甲双胍组给170 mg·kg-1·d-1(按成人剂量1.5 g/d折算)溶于5 ml蒸馏水中灌胃。正常对照组、模型组给予同量蒸馏水灌胃，各组按原饲料进行饲养。8周后，全部脱颈处死，取血及肝组织待测。
1.2.2 观察指标及检测方法：(1)观察大鼠食欲、体重、毛发及死亡情况。(2)血清指标测定：测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)、空腹血糖(FBS)、游离脂肪酸(FFA)；放免法测定空腹胰岛素(FINS)。胰岛素抵抗指数计算：胰岛素抵抗指数(HOMEIR)＝(FBS×FINS)/22.50。(3)取肝组织一块马上置于液氮中用RTPCR法检测肝组织中瘦素mRNA(leptin mRNA)的表达。
1.3 组织病理学标本的制备 取肝左叶用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，HE染色，光镜下观察组织学改变。
1.4 统计学处理 数据采用均数±标准差(±s)表示，使用SPSS11.5进行单因素方差分析和q检验。
2 结果
2.1 一般情况 在实验中，高脂饮食大鼠比正常组体重增加迅速，且皮毛发黄，蓬乱不顺滑。除4周时处死3只模型组大鼠外，其余均无死亡，随机处死的3只大鼠病理学检查证实存在肝脏脂肪变性。
2.2 肝脏组织病理学结果 Ⅰ、Ⅲ组的大鼠肝脏肉眼观察呈鲜红色，边缘锐利，表面光滑。Ⅱ组的大鼠肝脏体积增大，边缘变钝，颜色呈黄褐色，可见表面白色斑点，切面油腻感。光镜下观察，Ⅰ组大鼠肝小叶完整，肝细胞呈多边形，围绕中央静脉呈放射状。肝窦清晰可见，肝索排列整齐，肝小叶汇管区基本结构清晰可见。Ⅱ组大鼠肝脏肝细胞弥漫性脂肪变性，肝细胞内脂滴呈圆环形，较大的脂滴将肝细胞核挤向一侧。汇管区、小叶内有炎细胞浸润，炎症细胞以单核细胞、淋巴细胞为主，部分出现点状坏死、灶性坏死、碎屑样坏死。Ⅲ、Ⅳ组脂肪变的肝细胞数目明显减少，胞浆内脂滴减少或消失，仅有一些细小脂滴散布于肝细胞内，胞浆丰富，肝索排列整齐，仅见少量单核细胞，汇管区清晰，与肝小叶界限清楚。
2.3 各组转氨酶、FFA、血脂结果 见表1。Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组ALT、AST值均低于Ⅱ组，提示中药和二甲双胍均能降低ALT、AST，二甲双胍组ALT、AST值仍轻度高于对照组及中药组，但无统计学意义。各组CHO含量均较正常组高，Ⅲ、Ⅳ组CHO含量较Ⅱ组偏低，但差异无显著性。Ⅱ组TG含量高于其他各组。Ⅱ组FFA含量高于其他各组，治疗后两组FFA含量虽较模型组明显下降，但与对照组相比仍明显升高。可见中药与二甲双胍降TG、FFA效果明显，疗效相似，但降低CHO的效果不佳。
表1 大鼠转氨酶、FFA及血脂的变化(略)
注：与Ⅰ组比较，△P<0.05；与Ⅱ组比较，*P<0.05
2.4 血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数 见表2。空腹血糖各组之间差异无显著性，但模型组最高，然后依次是中药组、二甲双胍组及对照组。各组的胰岛素水平结果与血糖结果相类似。但使用胰岛素抵抗指数计算后发现Ⅱ组高于Ⅰ组，差异有显著性，Ⅲ、Ⅳ组胰岛素抵抗指数低于Ⅱ组高于Ⅰ组，但无统计学意义。
表2 大鼠FBS、INS及INS抵抗指数的变化(略)
注：与Ⅰ组比较，*P<0.05
2.5 肝组织瘦素mRNA和瘦素受体mRNA的表达
2.5.1 总RNA提取：异硫氰酸胍一步法提取大鼠肝组织的总RNA。进行实验分析所需的总RNA要求：电泳检测可清晰看到28 s、18 s两条rRNA电泳带，亮度之比接近2∶1。分光光度计检测浓度及纯度，λ260/λ280比值在1.7～2.0之间。电泳结果见图1。
图1 总RNA电泳图(上条带为28 s，下条带为18 s)(略)
2.5.2 半定量RTPCR结果：应用GIS2010凝胶图像分析系统进行灰度值分析，将瘦素及受体基因的灰度值除以G3PDH的灰度值所得结果为各个基因表达的相对强度。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组各瘦素mRNA变化分别为0.32±0.05、0.94±0.04、0.31±0.07与0.47±0.28。Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组瘦素mRNA值均低于Ⅱ组，提示中药和二甲双胍均能明显降低瘦素mRNA表达(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ组与Ⅰ组差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
本研究通过高脂饮食成功复制出大鼠脂肪肝模型，模型组动物转氨酶水平、血脂、胰岛素抵抗指数，肝组织瘦素表达均明显升高。二甲双胍是双胍类降糖药物，通过改善胰岛素敏感程度，促进外周组织摄取葡萄糖而起到降糖效果。实验中脂肪肝大鼠模型，虽然血糖及胰岛素水平升高，但差异无显著性[5]。经过计算胰岛素抵抗指数明显升高，提示其己存在胰岛素抵抗。通过二甲双胍治疗，肝功能好转，血脂、肝脂、胰岛素抵抗指数下降，肝组织学基本恢复正常，提示二甲双胍对实验性大鼠脂肪肝有效。而血清胆固醇无明显下降可能与用药时间较短有关。中医认为脂肪肝是由于过食肥甘厚味，或情志失调，或久病体虚，引起肝失疏泄、脾失健运、肾精亏损，湿邪、痰浊、癖血等病理因素淤积于肝所致。该方通过益肾固本、化痰祛癖，改善肝功能、降低血脂、减轻肝脏脂肪沉积。研究表明，中药丹参具有改善微循环、增加肝血流量作用，其煎剂对鼠及家兔有降脂，尤其降低甘油三酯的作用。机制可能是促进脂肪在肝中的氧化作用，从而降低肝中脂肪含量[6]。泽泻、大黄、何首乌、枸杞子可抑制外源性甘油三酯、胆固醇的吸收，影响内源性胆固醇代谢及抑制甘油三酯肝内合成，从而改善肝脏的脂肪代谢[7，8]。瘦素的主要作用是调节机体脂肪的稳定，还可以调节胰岛素、肾上腺素、生长激素、甲状腺素的分泌，促进生殖、造血、免疫及血管增生，并且具有排钠利尿作用。Tobe等[9]在研究血浆瘦素水平与脂肪肝关系实验中发现，脂肪肝患者血浆瘦素水平明显高于对照组，而且与转氨酶的升高平行。近年来研究表明[10，11]，瘦素与脂肪肝发病及胰岛素抵抗密切相关。肥胖时，瘦素水平升高，有效生物学作用明显下降，胰岛素水平亦明显升高，出现胰岛素抵抗。瘦素抵抗可能参与肝脏脂肪变性的形成。本组实验发现模型组动物体重增加，瘦素明显升高，提示有瘦素抵抗。Campillo等[12]认为在脂肪组织与胰岛之间可能存在“脂肪胰岛内分泌轴”，脂肪组织与胰岛之间通过瘦素与胰岛素形成一个双向反馈环。但在病理状态下，胰岛素对瘦素的敏感性下降，由于瘦素和胰岛素之间相互作用，出现高瘦素、高胰岛素水平。高循环瘦素水平又通过促进胰岛素抵抗和改变肝细胞的胰岛素信号，增加肝细胞内脂肪酸含量。二甲双胍和清脂益肝汤治疗的可能机制与改善胰岛素抵抗、减少脂肪吸收、降低炎性介质从而降低瘦素表达等多方面因素有关，但具体脂肪肝治疗与瘦素之间的关系尚需进一步研究。
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12 Campillo B，Sherman E,Richardet JP，et al.Serum leptin levels in alcoholic liver cirrhosis：relationship with gender，nutritional status，liver function and energy metabolism.Eur J Clin Nutr，2001，55：980988.
作者单位： 300170 天津市第三中心医院肝内科(阚志超、李岩)，急诊科(邵宏)，病理科(商国强)
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