外周血淋巴细胞和贲门癌细胞体外化疗药敏相关性研究
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[摘要]目的研究外周血淋巴细胞和贲门癌细胞体外药敏相关性。方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTr)快速比色法检测32例贲门癌患者外周血淋巴细胞与贲门癌细胞对9种化疗药物的敏感性。采用流式细胞免疫荧光法检测20例贲门癌患者外周血淋巴细胞与贲门癌细胞P-糖蛋白(P-gp)的表达。结果 外周血淋巴细胞与贲门癌细胞对9种化疗药物的平均抑制率呈正相关，其相关系数最大者为0.91，最小者为0.51，P均<0.05；而且两者P-糖蛋白(P-gp)的表达也呈正相关，相关系数为0.54(P<0.01)。结论贲门癌患者当不能取得手术标本时，可以用外周血淋巴细胞代替癌细胞进行M'l"r法体外药敏检测，为肿瘤患者的个体化用药提供一个新的治疗途径。
[关键词]贲门癌；外周血淋巴细胞；P-糖蛋白；四甲基偶氮唑盐快速比色法；流式细胞免疫荧光法
化学治疗(化疗)在贲门癌的综合治疗中占有重要的地位，但现行的化疗为传统经验方案，具有一定的盲目性。近年来，通过肿瘤化疗药敏实验指导个体化用药的研究，受到越来越广泛的重视。但是许多患者因失去手术机会、原发灶切除后化疗期形成耐药或其他原因无法获得肿瘤组织标本等而未能进行肿瘤细胞检测，从而不能实行个体化治疗。为此，我们采用四甲基偶氮盐(MTT)快速比色法检测了32例食管癌患者外周血淋巴细胞和肿瘤细胞对9种临床化疗药物的敏感性，并且采用流式细胞免疫荧光法检测两者P-糖蛋白(P-gp)的表达以探讨两者的相关性，为临床化疗个体化提供实验依据。
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1 材料与方法
1.1标本2004年10月至2005年12月我院胸外科经病理证实的贲门癌患者32例，采集其肿瘤组织标本和术前外周血淋巴细胞。
1.2药品 实验所用化疗药物均为贲门癌临床常用化疗药物：阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、环磷酰胺(CTX)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、长春新碱(VCR)、足叶乙甙(VP-16)、甲氨蝶呤(MTX)、卡铂(cBDCA)、吡喃阿霉素(THP)9种药物。各抗肿瘤药物实验浓度(c)均按公式：浓度(g/L)=mg×平均体表面积×100/平均质量×60计算，用生理盐水配制母液-20℃保存备用，实验时用培养液配制成工作液。
1.3试剂 四甲基偶氮唑盐(MrlT)(Sigma公司)，用生理盐水溶解，配制成5g/L的工作液，020℃保存；含10%小牛血清RPMI-1640养液(Gibco产品)，二甲基亚砜(DMSO)，淋巴细胞分离液(上海试剂二厂生产)。一抗为鼠抗人多药耐药基因单克隆抗体(克隆系JSB-1)，二抗为羊抗鼠FIFC-IgG(克隆号115095，Jackdson ImInuno Research，美国)。
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1.4方法
1.4.1 MTF比色法：①细胞分离和培养：在无菌条件下从患者体内取出肿瘤组织，放入装培养液的培养瓶中，尽快送实验室。采用机械法获取肿瘤单细胞悬液，经台盼蓝染色计数活细胞，用完全培养液调整细胞浓度为1×106/ml，接种于96孔板，每孔200μl。用淋巴细胞分离液从外周血中分离淋巴细胞(2000 r/min，20 min)后同法接种。②加药接种细胞后分别加抗癌药，每孔10μl，药物终浓度为所需浓度，另设空白对照孔及调零孔，每组4个复孔。加药后将96孔板放置于5%CO22培养箱，37℃培养。③MqT检测：培养48 h后，每孔加入5g/L MTF试剂10μl，继续培养4～6 h后加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，放震荡器震荡15 min使沉淀充分溶解，在酶标仪吸收波长570 nm条件下测定每孔OD值。
1.4.2流式免疫荧光法：①贲门癌单细胞悬液的制备：选用网搓法，将细胞悬液离心1000 r/min，5 min，单细胞悬液调至1×106/ml。②P-gp免疫荧光样品制备：用间接免疫荧光标记法。单细胞悬液用0.01 mol/LPBS离心洗涤2次，弃上清，加入1:10稀释的抗P-gp的单克隆抗体100μl，37℃中温浴30 min，PBS离心洗涤2次，弃上清，加入1:200稀释的羊抗鼠异硫氰酸荧光素(FIFC-IgG)100μl，37℃中温浴30 min，离心洗涤多余荧光抗体，上机前加入PBS 1.0 ml，500目筛网过滤。并设有PBS溶液代替一抗和二抗的阴性对照以及只加一抗或二抗的阳性对照。③流式细胞仪检测方法：FACS-420型流式细胞仪以2 w氩离子激光器为激光源，激光波长为480 nm，输入HP-300 Consort计算机，应用相应的软件程序进行资料分析。
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1.5结果判定：(1)化疗药物抑制率公式：抑制率(IR)＝(对照孔平均OD值-加药孔平均OD值)÷对照孔平均OD值×100%。(2)P-糖蛋白含量测定：按照Morkey提出的荧光指数(FI)来计算P-糖蛋白含量。
1.6统计学分析 所测数据用SAS软件包统计处理，采用Spearman等级相关检验、直线相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
外周血淋巴细胞与贲门癌细胞对9种化疗药物的药物平均抑制率呈正相关，其相关系数最大者为0.91，最小者为0.51，见表1；而且两者P_糖蛋白的表达也呈正相关，相关系数为0.54，P<0.01，见表2。
3 讨论
目前化疗药物的最大缺点是特异性差，在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤造血淋巴系统和胃肠上皮细胞等生长旺盛组织细胞。近年来的研究表明，同一种肿瘤不同个体对同种化疗药物的敏感性却不尽相同，故导致临床疗效不同，因此个体化治疗已在肿瘤界成为共识。但是，MTT法同其他体外药敏方法一样具有肿瘤标本取材困难的缺点，尤其是对于很大一部分晚期癌症和新辅助化疗患者，难以取材标本，因此无法进行药敏实验，只能凭经验化疗。因此急需寻找一种容易获得的、可替代肿瘤进行化疗药敏检测的组织或细胞。
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实验结果显示，贲门癌患者外周血淋巴细胞和贲门癌细胞的药敏平均抑制率呈正相关性；而且两者P-糖蛋白的表达也呈正相关。提示，外周血淋巴细胞可代替贲门癌细胞进行体外药敏检测。多药耐药基因(mdr-1)及其产物P-糖蛋白的过度表达是多药耐药性(MDR)产生的主要原因。P-gp属于一种依赖ATP供能的转运蛋白，主要分布在细胞膜上，其功能涉及到转运细胞中其生存环境间的多种物质，如肽类、内源性激素、异生物(包括各种天然及半合成化疗物)，在某些生理情况下，还可以作为氯离子通道，转运氯离子。P-糖蛋白发挥能量依赖性外排泵的作用对象无特异性。同一个体的外周血淋巴细胞和贲门癌细胞具有相同的基因型，具有相同的多药耐药基因(MDR-1)表达，在药物的作用下上述细胞多药耐药基因(MDR-1)表达增加，从而形成两者的相关性。
本研究表明，对于无法取到肿瘤标本进行肿瘤细胞药敏检测的贲门癌患者，可用外周血淋巴细胞药敏检测代替肿瘤细胞药敏检测，以淋巴细胞药敏结果判断肿瘤细胞的敏感性，特别是对经化疗后产生耐药性的肿瘤患者，外周血淋巴细胞药敏检测对临床药物选择更具有意义。, 百拇医药(周韶辉 王 静 阎志军)