诱导家蝇幼虫产生抗菌物质的实验研究
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【摘要】 目的 对家蝇体内的抗菌物质进行研究。方法 通过喂菌及超声诱导家蝇幼虫产生抗菌物质，采用比浊法对家蝇体内抗菌物质的活性进行测定。结果 家蝇经诱导后产生的抗菌物质具有较好的杀菌效果，但对不同细菌所产生的杀菌效果有一定差别。结论 研究结果可为进一步纯化和分析家蝇体内的抗菌蛋白奠定了基础。
【关键词】 家蝇；抗菌物质；抗菌活性
大量研究认为，昆虫免疫系统具有对异物的免疫应答能力，一些外源物质，如细菌、理化因素等，均能使昆虫产生抗菌物质[1]。家蝇(Musca domestica)的生活环境中杂菌横生，其成虫也以多种方式传播各种疾病，如伤寒、痢疾、霍乱等，而它自身却很少被感染，说明家蝇对病原微生物有强大的免疫力，并能产生强效抗菌物质。现已从尾别麻蝇(Sarcophaga peregrina)和大头金蝇(Chrysomyia megacephala)等体内分离到抗菌物质[1]。本文采用了喂菌及超声作为诱导源来刺激家蝇幼虫产生抗菌物质，并通过比浊法测定其抗菌活性。通过本实验为家蝇幼虫抗菌蛋白的进一步研究提供了实验依据。
材料与方法
1.材料 ①家蝇幼虫：诱捕野生家蝇产卵孵化而来。②大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌为实验室保存的菌种。③乙酸铵提取液：参照文献[2]配制0.05 mmol/L乙酸铵缓冲液，调pH至5.0，按0.35 μg/ml 加入PMSF(临用前加入)。
2.方法
(1)抗菌物质的诱导 先后采取喂菌及超声两种诱导方式。将家蝇幼虫养至3龄，分出一部分置另一容器中，所配制的饲料中含有大量金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(每100克饲料中含有处于对数期的两种细菌各10 ml)，培养24小时后，再将经细菌喂养的幼虫清洗干净后，置于干净烧杯中，加入少量无菌去离子水，放在超声波洗涤仪中进行超声波处理60秒。将诱导后的幼虫放回已准备好的家蝇饲料中继续养殖24小时。
(2)抗菌物质的提取 将诱导处理后的家蝇幼虫先用无菌水洗净，在无菌滤纸上吸干虫体表面水分，称鲜重。取重量20克的幼虫，100℃沸水瞬时处死，立即用冰水冲洗，滤掉水分，放入匀浆机中按1∶2的比例加入乙酸铵提取液，充分匀浆，将匀浆液倒入一预冷的大离心管内，用12000 r/min高速4℃离心30 min，提取上清液于一烧杯中，再将烧杯置于沸水浴中搅拌加热5 min后，迅速置冰上冷却，12000 r/min 高速4℃离心30 min，再次提取上清液，最后将提取液冷冻干燥后，用去离子水按原体积的1/10稀释，将所得到的浓缩液放-20℃冰箱保存备用。
(3)比浊法抗菌活性测定 用LB培养液活化大肠杆菌、金黄色葡萄球、绿脓杆菌到对数期，5000 r/min离心5分钟，收集菌体，重新加入新鲜的LB培养液至对数期，测A570为0.3~0.6,分别吸取菌悬液1 ml，并分别加入10 μl的家蝇幼虫提取浓缩液(测定管)，同时作对照管(加10 μl的乙酸铵提取)。测吸光度值后，放入37℃培养，分别于5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟时测吸光度值。并且于相应时间吸取少量菌悬液，稀释一定倍数后铺平板，37℃培养一天后统计菌落个数，得到的数据用于统计学分析。
结果
诱导家蝇幼虫产生的抗菌物质的活性分析，以共育时间为X轴，以反应体系的吸光度为Y轴作图，动力学分析结果，当样品提取液分别加入到对数期大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌的菌悬液中，经37℃培养后，大肠杆菌悬液及金黄色葡萄球菌悬液的OD值均有下降趋势，而绿脓杆菌悬液的OD值仍有增高趋势。仅加入乙酸铵提取液的相应对照管，经37℃培养后，由于细菌的大量繁殖使OD值均出现明显上升的趋势。此结果显示，经喂菌及超声诱导产生的抗菌物质有显著的杀菌及抑菌作用，在本研究所选择的三种菌中，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的作用较强，而对绿脓杆菌作用较弱(见图1)。
(1) (2) (3)
图1 家蝇幼虫抗菌物质提取液的杀菌动力学(略)
(1) 大肠杆菌 (2)金黄色葡萄球菌 (3)绿脓杆菌
相同体系的三种细菌和家蝇幼虫提取液共育过程中,在不同的时间取出一定量的菌液稀释涂平板,37℃培养一天后统计菌落数。当样品加入大肠杆菌及金黄色葡萄球菌悬液中，活菌数迅速下降，而绿脓杆菌细菌浓度则有轻度升高趋势(见图2)， 此结果与图1的结果吻合，同时进一步说明了经喂菌及超声诱导家蝇幼虫产生的抗菌物质具有杀菌作用，但对不同细菌所产生的效果不同。
图2 (略)
1.大肠杆菌 2.金黄色葡萄球菌 3.绿脓杆菌
讨论
家蝇幼虫对各种诱导源的作用具有免疫应答能力，所产生的抗菌物质存在于血淋巴中，其理化性质稳定，尤其具有较高的热稳定性[3]。在以往的研究中多以针刺法诱导家蝇幼虫提取抗菌物质，但此法费时费力，且因家蝇幼虫虫体小而仅限于小量提取。本研究则通过喂菌及超声两种方式诱导家蝇幼虫产生抗菌物质，该诱导方式简便且效果较好，适合于大批量抗菌物质的提取。通过对抗菌活性的测定结果显示，家蝇经诱导后产生的抗菌物质具有较好的杀菌作用，对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌作用较强，而对绿脓杆菌作用较弱，表明家蝇抗菌物质虽有对动、植物病原菌的广谱抗菌性，但对不同细菌所产生的抗菌效果有一定差别。
随着抗生素被大量的使用，病原体的抗药性也日渐明显。人们急于寻找到适合的抗生素的替代物，昆虫抗菌肽的开发和利用是一个很好的尝试。通过本实验对家蝇抗菌物质的研究和进一步分离纯化奠定了基础。
参考文献
[1]齐静姣，曲传智.不同诱导源诱导家蝇抗菌物质的动力学研究[J].中国人兽共患病杂志，2004，20(6)：554-555.
[2]宫 霞，乐国伟，施用晖，等.电泳制备家蝇幼虫抗菌肽及其性质[J].无锡轻工业大学学报，2003，11:26.
[3]刘 晖，万启惠，张 曦，等.诱导家蝇幼虫抗菌蛋白的提取及动力学研究[J].中国公共卫生，2004，20(4): 427.
(编辑：崔群飞)
(长治医学院附属和平医院检验科，山西长治 046000；重庆医科大学医学检验系，重庆 400016)
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