白英提取物诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡及其对凋亡相关基因表达的影响(2)
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(4)TUNEL法检测细胞凋亡 细胞凋亡检测步骤按原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。药物作用后，收集各组细胞，用PBS漂洗两遍后进行细胞涂片，风干后丙酮固定15 min；细胞在渗透液(0.2%Triton X-100，0.1%柠檬酸钠)中孵育5 min，双蒸水冲洗玻片；滴加TUNEL反应混合物，37℃湿盒中孵育30 min；滴加转化剂-POD，37℃湿盒中孵育30 min，冲洗玻片；滴加DAB底物溶液，室温5~10 min；蒸馏水冲洗，苏木素复染、脱水、封片；以不加TUNEL反应混合液作为阴性对照。细胞核呈棕黄色为TUNEL反应阳性细胞(即凋亡细胞)。光镜下分析结果，随机计数10个高倍视野下阳性细胞所占百分数即为细胞凋亡率。
(5)半定量RT-PCR检测基因mRNA表达 药物处理细胞后，按Trizol试剂盒的说明书提取总RNA。Survivin，caspase-3和内对照β-actin引物借助primer premier 5.0软件设计，并经Genebank验证(见表1)。按试剂盒说明采用一步法进行RT-PCR。RT-PCR反应体系总体积50 μl，逆转录45℃×45 min，AMV RT灭活和预变性94℃×2 min，然后进行PCR 35个循环(94℃×30 s ......
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