C5位上羟基对染料木黄酮抑制重组人蛋白激酶CK2活性的影响(2)
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3.克隆、表达和纯化人CK2α’和β亚基 人CK2α’和β亚基cDNA重组质粒pTCKA'和pTCKB的克隆与测序见我们以前的报道[9，10]。重组人CK2α’和β亚基的原核表达、纯化与鉴定见我们以前的报道[9，11]。
4.体外重组人CK2的蛋白定量 按常规的考马斯亮蓝R250染色法，以牛血清白蛋白作为标准[12]。
5.体外重组人CK2的活性测定 酶反应总体积为35 μl，反应混合液中含：50 mmol/L TrisHCl，150 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，10 μmol/L ATP，[γ32P]ATP 1.85×104Bq(比活1.85×1017Bq/mol)，去磷酸化酪蛋白2 g/L，pH 7.2。反应温度为30℃。将纯化的重组人CK2α’与β亚基按等摩尔(14 pmol)混合构成重组人CK2全酶。加重组CK2全酶10 μl启动酶反应，反应10 min后取30μl点至直径2 cm的P81磷酸纤维素滤纸上终止反应，阴干，用85 mmol/L 磷酸洗涤8次，最后用丙酮洗涤1次，80℃烤干后，加闪烁液于液闪仪计数，每组同时做3个平行管。
6.染料木黄酮和大豆甙元对重组人CK2全酶的直接作用及半数抑制浓度(IC50)的计算 将纯化的重组人CK2α’与β亚基按等摩尔(14 pmol)混合构成重组人CK2全酶。在每个反应管中分别加入10 μl不同浓度的受试化合物，加入15 μl反应混合液，以10 μl全酶启动反应从而观察受试化合物对CK2全酶活性的影响。IC50的计算根据半数效量概率单位法[13]进行。以浓度的对数为横坐标，相应浓度抑制率的概率单位(probit)为纵坐标，求出直线回归方程，并根据方程计算IC50值(50%抑制时的概率单位为5)。
7.统计学处理 以SPSS 11.0软件做统计学数据处理 ......
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