葡萄球菌生物膜检测及与耐药性的关系(2)
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2.方法
(1)生物膜定性 用选择血平板分离单个菌落接种于刚果红培养基上(刚果红0.8 g/L，脑心浸液干粉47 g/L，蔗糖36 g/L)，37℃培养24小时后，再在室温放置24小时，金葡菌置72小时。产生生物膜的菌落变为黑色，不产生生物膜的菌落仍为红色。
(2)生物膜半定量 ①不同条件下生物膜生长情况的观察：从血平板分离的单个菌落接种于5 mlTSB、调成0.5麦氏浓度，分别用TSB、TSB-0.25%Glu、TSB-2%NaCl、TSB-4%NaCl、TSB-2%Alc、TSb-4% Alc37℃培养12小时。观察哪项为最佳培养浓度。
②半定量测定：分别用TSB、TSB-0.25%Glu、TSB-2%NaCl、TSB-4%NaCl、TSB-2%Alc、TSB-4% Alc 1∶100稀释后，加入96孔板，每孔200 μl，每株菌6个平行孔，37℃培养24小时后，使用蒸馏水洗板三次，加入0.1%蕃红花T染液200 μl染1 min，再用蒸馏水洗板三次，加入蒸馏水200 μl，用酶标仪490 nm比色，读取数值。每个96孔板包括空白对照(单纯TSB)、阴性对照。选刚果红培养阴性，半定量培养20次均与空白对照吸光度值相近，为阴性对照株。
(3)药敏试验采用Kirby-Bauer琼脂扩散法 按美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS2000年版)判断标准和质控要求进行操作和判读结果。抗菌药敏纸片有：苯唑西林、青霉素、复方新诺明、红霉素、克林霉素、万古霉素、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、四环素、替考拉宁、阿莫西林/克拉维酸。
(4)统计学处理 采用卡方检验和方差分析对两组生物膜阳性率及吸光度进行统计学处理。
结果
1.生物膜定性检测结果 30株金葡菌中5株产生生物膜，阳性率为16.7%；30株表皮葡萄球菌中有 12株产生生物膜，阳性率为40.0%；30株腐生葡萄球菌中有3株菌产生生物膜，阳性率为10.0%。经卡方检验,两组阳性率的结果比较都有显著性差异(P<0.05)，表皮葡萄球菌的阳性率最高，其次为金黄色葡萄球菌，最后为腐生葡萄球菌。(见表1和表2)
2.生物膜半定量检测结果 阳性株筛选条件为：阴性对照平均值±3倍标准差(阴性对照为0.1±0.05)，阳性标准>0.3，表皮葡萄球菌生物膜阳性率TSB、TSB-0.25%Glu、TSB-2%Alc、TSB-4%Alc、TSB-2%NaCl和TSB-4%NaCl分别为13 ......
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