老年脑梗死患者血清对氧磷酸酯酶-1和氧化型低密度脂蛋白的关系及其在动脉粥样硬化中的作用(2)
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2.入选及排除标准：入选标准：①参照全国第四届脑血管病学术会议制定的脑梗死诊断标准，结合临床及影像学(头颅 MRI/CT)表现，确诊为缺血性卒中；②住院期间均行全脑血管造影术，确诊颈总动脉或颈内动脉颅外段存在不同部位、不同程度狭窄。排除标准：①TIA、心源性脑梗死和冠心病；②全身大动脉疾病和代谢性疾病者；③严重肝肾功能不全者；④急慢性感染患者。
3.DSA检查方法 采用德国西门子大型C臂数字减影血管造影机AXIOMArtisdTA进行检查，用改良Seldinger 法行股动脉穿刺置5F鞘，插管，分别行主动脉弓、双侧颈总动脉、颈内动脉、椎动脉造影。动脉狭窄程度判断：狭窄率(%) = (狭窄远端正常直径-最狭窄段直径) /狭窄远端正常直径。狭窄率<50%为轻度狭窄， 50%~69%为中度狭窄， 70%~99%为重度狭窄，100%为闭塞。
4.血样采集 所有受检者于清晨采集静脉血液4 ml，室温下2500 r/min离心10 min，取血清于-20℃保存，用于PON-1、ox-LDL及其它生化指标的检测。
5.测定方法 采用分光光度计法测定PON-1活性，酶活性计算公式：PON-1活性(kU/L) = A×103×f×FV/(t×SV×L×ε)；A为净吸光度值(即标本吸光度值-血清对照和底物对照的吸光度值)，f为标本稀释倍数，FV为反应终体积，t为反应时间，SV为样品体积，L 为光径，ε为摩尔消光系数，酶的活性单位定义为每分钟催化1 μmol乙酸苯酯水解所需的酶量为1 U。采用ELISA法测定ox-LDL，试剂盒由美国SIGMA公司提供，具体操作严格按试剂盒说明书进行。其它生化指标由检验科按常规检查完成。
6.统计学方法 实验数据以均数±标准差(-x±s)表示，应用SPSS13.0统计软件进行统计分析，两样本均数比较采用t检验；多个样本均数比较采用单因素方差分析，再用LSD法进行两两比较；相关关系采用Spearman相关分析，P<0.05为有统计学意义。
结果
1.对照组与脑梗死组患者的血清PON-1活性和ox-LDL含量比较 脑梗死组患者的血清PON-1活性显著低于对照组(P<0.01)，而ox-LDL含量显著高于对照组(P<0.01)。见表1。
2.不同狭窄组患者的血清PON-1活性和ox-LDL含量比较 各狭窄组患者PON-1活性与ox-LDL含量差异均有统计学意义(P<0.01)，并且PON-1活性随颈动脉狭窄程度加重，呈逐渐下降的趋势，而ox-LDL含量随颈动脉狭窄程度加重呈上升趋势。见表2。
3.相关性分析 Spearman相关分析结果显示，PON-1活性与ox-LDL呈负相关(r=-0.68，P<0.01)，而与血脂其它各项指标均无相关性(P>0.05)。见表3。
讨论
近年来一些生物酶类在动脉粥样硬化发病中的作用备受关注，其中PON-1已成为研究热点。PON-1是由肝脏合成的分子量约45 kD的水解脂酶，含355个氨基酸残基，与HDL紧密结合。研究发现，PON-1基因敲除的小鼠血管抗黏附能力下降、氧化应激损害加重和血栓形成增加[2]。用含有PON-1基因腺病毒转染载脂蛋白E基因敲除的小鼠后，发现氧化应激和血管内皮功能改善，动脉粥样硬化病灶部位的血管平滑肌细胞钙离子稳定[3]。在一项有关PON-1基因多态性的研究中显示PON-1活性最高时心血管疾病发生率最低[4]。在糖尿病并发血管病变领域中研究发现，2型糖尿病患者血清PON-1活性较正常对照组显著降低，有微血管病变组显著低于无微血管病变组[5]。本研究结果显示脑梗死组患者血清PON-1活性低于对照组(P<0.01)，各狭窄组患者血清PON-1活性差异有统计学意义(P<0.01)，并且随颈动脉狭窄程度加重，呈逐渐下降的趋势，进一步证实PON-1为诱发缺血性脑卒中的危险因素，参与动脉粥样硬化的发生发展，对缺血性脑卒中的病情有预警价值。
本研究结果显示脑梗死组患者血清ox-LDL含量显著高于对照组(P<0.01)，重度狭窄组高于中度狭窄组和轻度狭窄组，中度狭窄组高于轻度狭窄组，与Uno等[6]报道相一致。提示合并颈动脉狭窄的脑梗死患者存在明显的脂质过氧化状态，并且与病变严重相关。ox-LDL不再被受游离胆固醇负反馈调节的脂蛋白受体识别，而由巨噬细胞表面的清道夫受体A识别，并吞噬形成泡沫细胞，参与动脉粥样硬化的发生。此外，ox-LDL还能刺激内皮细胞分泌多种炎性因子和黏附分子，诱导单核细胞黏附、迁移进入动脉内膜并转化为巨噬细胞；诱导血管平滑肌细胞增殖、细胞体变大，由收缩表型向合成表型转变，并有迁移和游走作用；激活血小板活化因子增加血小板的凝聚性；刺激组织型纤溶酶原激活物抑制物-1，同时抑制组织型纤溶酶原激活物，破坏凝血系统的平衡；抑制一氧化氮(NO)释放促进血管收缩，加剧动脉粥样硬化的炎症反应等，通过多种途径启动和加速动脉粥样硬化形成。
本研究Spearman相关分析显示PON-1活性与血脂各项指标间无显著相关性，而与ox-LDL呈负相关，与戚国庆等[7]在冠心病领域的研究结果相似，说明PON-1 活性并未影响血脂水平的高低，而PON-1活性与ox-LDL之间存在联系，PON-1活性下降可以通过影响ox-LDL水平使其升高而导致脂质过氧化增强，加速动脉粥样硬化发生发展。研究表明，PON-1具有过氧化物酶活性，可以抑制LDL氧化，清除存在于ox-LDL中的致炎性氧化磷脂，并参与胆固醇过氧化物的代谢。体外实验证实，纯化的或结合在HDL上的PON-1能水解氧化性磷脂和胆固醇过氧化物，抑制Cu2+诱导的LDL氧化，减少ox-LDL 的生成。体内研究发现，PON-1也有保护低密度脂蛋白免受氧化修饰，减少 ox-LDL水平和含量。HDL上的PON-1可以通过水解LDL最易被氧化的sn2位点上的不饱和脂肪磷酸脂而稳定c9位脂肪酸片段，丢弃磷脂，使LDL免于氧化。说明PON-1能通过多途径保护LDL免受氧化修饰，降低体内ox-LDL水平，具有抗动脉粥样硬化作用。由于合并动脉粥样硬的脑梗死患者PON-1活性降低，抗氧化能力下降，导致LDL氧化为ox-LDL，ox-LDL损伤微血管内皮细胞的结构和功能，诱导微血管平滑肌细胞增殖和金属蛋白酶的表达，破坏凝血系统，加剧炎症反应，激活凝血因子、促进血小板黏附和聚集 ......
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