红薯叶总黄酮对小鼠脑缺血缺氧保护作用的研究(1)
【摘要】 目的 探讨红薯叶总黄酮对小鼠急性脑缺血缺氧的作用。方法 制备红薯叶总黄酮溶液，通过饱和MgCl2致小鼠急性脑缺血实验、NaNO2中毒性缺氧实验、常压耐缺氧实验和小鼠断头实验，检测急性脑缺血缺氧小鼠脑组织中总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛 (MDA)含量变化。结果 与正常对照组比较，各给药组小鼠的存活时间均延长，差异有统计学意义(P<0.05或0.01);各给药组脑指数和MDA含量均下降，T-SOD活性提高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 红薯叶总黄酮溶液对脑缺血缺氧损伤有一定的保护作用。
【关键词】 红薯叶总黄酮;脑缺血缺氧;小鼠;保护作用
中图分类号：R285.5 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.06.002
紅薯味甘，性平，具有补中、益气、健脾、通便等多种功效，是我国主要农作物之一。现代科学研究表明红薯茎、叶中富含各种化学成分，其提取物具有广泛的医疗和保健作用。目前，对红薯叶的研究主要集中在其提取物黄酮化合物及其功能、活性多糖及其功能和红薯叶作为保健食品的开发利用等方面。研究证实，红薯叶黄酮化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抗菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射、治疗腹泻等多重作用[1]。“药食同源”是中医推崇的疾病防治方法，经常食用红薯叶有美容护肤，延年益寿的功效，在欧美、日本等国家及香港地区掀起一股“红薯叶热”，而在国内大部分地区红薯叶却被废弃或作为动物饲料，没有得到充分的利用。因此，对红薯叶进行开发利用具有广阔的市场前景[2]。目前为止尚未发现红薯叶总黄酮对缺血性脑血管疾病的相关研究，本实验通过构建四个经典小鼠急性脑缺血缺氧模型，观察红薯叶总黄酮对脑缺血缺氧的保护作用，并初步探讨其可能的作用机制，为红薯叶的开发利用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 仪器
KQ5200DB型数控超声波清洗器、电热恒温水浴锅、旋转蒸发仪、FSH-2A可调高速电动匀浆机、高速台式离心机、722型分光光度计、FA(N)/JA(N)电子天平。
1.1.2 动物
SPF级昆明小鼠120只[由右江民族医学院动物实验中心提供，许可证号：SCXK(桂)2017-2003，使用许可证号：SYXK(桂)2017-0004]，雄雌各半，体重(20±2)g。小鼠在正式实验前均在SPF级实验室适应性饲养一周，自由采食和饮水。
1.1.3 药品
红薯叶(采摘于广西百色市);尼莫地平片(四川科伦药业股份有限公司，生产批号：B160309015);乙醇(分析纯，生产批号：20170115，天津市富宇精细化工有限公司);钠石灰(生产批号：20170210，上海纳辉干燥试剂厂);总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒(生产批号：20170809)、丙二醛 (MDA)测定试剂盒(生产批号：20170806)和总蛋白测定试剂盒(生产批号：20170809)，均购自南京建成生物工程研究所。
1.2 实验方法
1.2.1 红薯叶总黄酮的制备
(1)提取：采集新鲜的红薯叶去杂、清水漂洗并沥干其表面水分，(80±1)℃鼓风干燥72 h以上，冷却后粉碎，过40目筛后，置干燥器备用。精密称取红薯叶粉末200 g，加2000 mL 70%乙醇，密闭浸泡过夜，超声波提取2.5 h，抽滤。滤渣再加1500 mL 70%乙醇，超声波提取1.5 h，抽滤，合并两次滤液，旋转蒸发，然后用乙酸乙酯萃取3次，真空干燥，得到红薯叶粗制总黄酮粉末。(2)纯化：将提取得到的粗黄酮化合物在AB8大孔树脂柱上进行纯化，用500 mL 60%乙醇洗脱，收集乙醇部分，减压浓缩，在冷冻机中干燥得到纯化黄酮。(3)鉴定：将纯化后得到的总黄酮取少量溶于1 mL甲醇溶液试管中，加入浓盐酸2～3滴，再加少量镁粉，观察到玫瑰红色即可确定为红薯叶总黄酮。(4)含量的测定：采用以芦丁为标准品的比色法测定总黄酮含量。
1.2.2 小鼠急性脑缺血实验[3]
1.2.2.1 饱和MgCl2致小鼠急性脑缺血实验
SPF级昆明小鼠30只，雌雄各半，体重(20±2)g，随机分成三组：空白组、总黄酮提取组、尼莫地平组;每天灌胃，红薯叶总黄酮提取组和尼莫地平组的给药剂量分别为200 mg·kg-1、18 mg·kg-1，空白组用等量生理盐水灌胃，连续7天，末次给药1 h后，小鼠尾静脉注射饱和MgCl2溶液(0.1 mL·10 g-1)，记录存活时间为从注射药品至最后一次张口喘息的时间。
1.2.2.2 4%NaNO2溶液腹腔注射所致小鼠中毒性缺氧实验
SPF级昆明小鼠30只，雌雄各半，体重(20±2)g，分组及给药方法同1.2.2.1，NaNO2给药剂量为(0.1 mL·10 g-1)
1.2.2.3 常压耐缺氧实验
SPF级昆明小鼠30只，雌雄各半，体重(20±2)g，分组及给药方法同1.2.2.1，末次给药1 h后，将小鼠放入装有20 g钠石灰的150 mL的带塞的广口瓶中，记录小鼠从放入瓶中至停止呼吸的时间。
1.2.2.4 小鼠断头实验
SPF级昆明小鼠30只，雌雄各半，体重(20±2)g，分组与操作方法同1.2.2.1，末次给药前称重，给药后1 h，迅速从小鼠耳后颈部断头，记录小鼠张口喘息次数和喘息维持的时间，然后冰上取全脑，计算脑指数。再用9倍4 ℃生理盐水将脑组织匀浆，制成10%匀浆液，离心取上清4 ℃保持备用。, http://www.100md.com(杨敏 杨立轩 韦妮 冯洁 郭子鹏 凌秀孟 莫庸 韦金花 王俐 谢尤祥 冯雪萍)
【关键词】 红薯叶总黄酮;脑缺血缺氧;小鼠;保护作用
中图分类号：R285.5 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.06.002
紅薯味甘，性平，具有补中、益气、健脾、通便等多种功效，是我国主要农作物之一。现代科学研究表明红薯茎、叶中富含各种化学成分，其提取物具有广泛的医疗和保健作用。目前，对红薯叶的研究主要集中在其提取物黄酮化合物及其功能、活性多糖及其功能和红薯叶作为保健食品的开发利用等方面。研究证实，红薯叶黄酮化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抗菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射、治疗腹泻等多重作用[1]。“药食同源”是中医推崇的疾病防治方法，经常食用红薯叶有美容护肤，延年益寿的功效，在欧美、日本等国家及香港地区掀起一股“红薯叶热”，而在国内大部分地区红薯叶却被废弃或作为动物饲料，没有得到充分的利用。因此，对红薯叶进行开发利用具有广阔的市场前景[2]。目前为止尚未发现红薯叶总黄酮对缺血性脑血管疾病的相关研究，本实验通过构建四个经典小鼠急性脑缺血缺氧模型，观察红薯叶总黄酮对脑缺血缺氧的保护作用，并初步探讨其可能的作用机制，为红薯叶的开发利用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 仪器
KQ5200DB型数控超声波清洗器、电热恒温水浴锅、旋转蒸发仪、FSH-2A可调高速电动匀浆机、高速台式离心机、722型分光光度计、FA(N)/JA(N)电子天平。
1.1.2 动物
SPF级昆明小鼠120只[由右江民族医学院动物实验中心提供，许可证号：SCXK(桂)2017-2003，使用许可证号：SYXK(桂)2017-0004]，雄雌各半，体重(20±2)g。小鼠在正式实验前均在SPF级实验室适应性饲养一周，自由采食和饮水。
1.1.3 药品
红薯叶(采摘于广西百色市);尼莫地平片(四川科伦药业股份有限公司，生产批号：B160309015);乙醇(分析纯，生产批号：20170115，天津市富宇精细化工有限公司);钠石灰(生产批号：20170210，上海纳辉干燥试剂厂);总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒(生产批号：20170809)、丙二醛 (MDA)测定试剂盒(生产批号：20170806)和总蛋白测定试剂盒(生产批号：20170809)，均购自南京建成生物工程研究所。
1.2 实验方法
1.2.1 红薯叶总黄酮的制备
(1)提取：采集新鲜的红薯叶去杂、清水漂洗并沥干其表面水分，(80±1)℃鼓风干燥72 h以上，冷却后粉碎，过40目筛后，置干燥器备用。精密称取红薯叶粉末200 g，加2000 mL 70%乙醇，密闭浸泡过夜，超声波提取2.5 h，抽滤。滤渣再加1500 mL 70%乙醇，超声波提取1.5 h，抽滤，合并两次滤液，旋转蒸发，然后用乙酸乙酯萃取3次，真空干燥，得到红薯叶粗制总黄酮粉末。(2)纯化：将提取得到的粗黄酮化合物在AB8大孔树脂柱上进行纯化，用500 mL 60%乙醇洗脱，收集乙醇部分，减压浓缩，在冷冻机中干燥得到纯化黄酮。(3)鉴定：将纯化后得到的总黄酮取少量溶于1 mL甲醇溶液试管中，加入浓盐酸2～3滴，再加少量镁粉，观察到玫瑰红色即可确定为红薯叶总黄酮。(4)含量的测定：采用以芦丁为标准品的比色法测定总黄酮含量。
1.2.2 小鼠急性脑缺血实验[3]
1.2.2.1 饱和MgCl2致小鼠急性脑缺血实验
SPF级昆明小鼠30只，雌雄各半，体重(20±2)g，随机分成三组：空白组、总黄酮提取组、尼莫地平组;每天灌胃，红薯叶总黄酮提取组和尼莫地平组的给药剂量分别为200 mg·kg-1、18 mg·kg-1，空白组用等量生理盐水灌胃，连续7天，末次给药1 h后，小鼠尾静脉注射饱和MgCl2溶液(0.1 mL·10 g-1)，记录存活时间为从注射药品至最后一次张口喘息的时间。
1.2.2.2 4%NaNO2溶液腹腔注射所致小鼠中毒性缺氧实验
SPF级昆明小鼠30只，雌雄各半，体重(20±2)g，分组及给药方法同1.2.2.1，NaNO2给药剂量为(0.1 mL·10 g-1)
1.2.2.3 常压耐缺氧实验
SPF级昆明小鼠30只，雌雄各半，体重(20±2)g，分组及给药方法同1.2.2.1，末次给药1 h后，将小鼠放入装有20 g钠石灰的150 mL的带塞的广口瓶中，记录小鼠从放入瓶中至停止呼吸的时间。
1.2.2.4 小鼠断头实验
SPF级昆明小鼠30只，雌雄各半，体重(20±2)g，分组与操作方法同1.2.2.1，末次给药前称重，给药后1 h，迅速从小鼠耳后颈部断头，记录小鼠张口喘息次数和喘息维持的时间，然后冰上取全脑，计算脑指数。再用9倍4 ℃生理盐水将脑组织匀浆，制成10%匀浆液，离心取上清4 ℃保持备用。, http://www.100md.com(杨敏 杨立轩 韦妮 冯洁 郭子鹏 凌秀孟 莫庸 韦金花 王俐 谢尤祥 冯雪萍)