白假丝酵母菌检测技术的发展及评价(1)
【关键词】 白假丝酵母菌;检测技术;基因分型;质谱
中图分类号：R446.5 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.05.017
白假丝酵母菌(candida albicans)俗称白色念珠菌，在一定条件下可侵犯皮肤、黏膜、内脏和血液，引起继发性感染，表现为急性、亚急性或慢性炎症。近年来，医学诊断和治疗技术的迅猛发展，使得各种危重症患者的病死率有所下降，与此同时各种新医疗技术越来越多地被应用，以及免疫缺陷患者增多，人口老龄化日益加剧，条件致病性真菌引发的深部真菌性疾病发生率愈来愈高，严重威胁着患者的身体健康和生命安全，受到医学界的高度重视[1]。对人类致病的深部真菌病原菌主要有假丝酵母菌属、酵母菌属以及曲霉菌属，其中，白假丝酵母菌引起的真菌感染是最常见的一种，有研究表明，在亚洲白假丝酵母菌引起深部真菌病的病死率高达30.0%左右[2]。以往针对白假丝酵母菌传统的分类系统研究方法，如形态学法、生物学法、组织发生学法、血清学法以及药敏谱类型分析等存在区分率较低，易受外环境影响，重复性、精准性较差的缺点，已不能对其进行更深入而有效的分析与研究。目前，随着生命科学及医疗科技的发展，以PCR为基本原理的分子生物学技术以及更高端精准的微生物质谱分析技术已逐步应用于医学研究领域，解决了一些传统检测技术不能解决的问题。现将白假丝酵母菌临床检测及分型技术的研究进展综述如下。
1 白假丝酵母菌检测技术
白假丝酵母菌的基本检测技术包括培养方法和非培养方法，培养方法可分为大培养和小培养两种;非培养方法则包括：显微镜检查、抗原抗体和特异性代谢产物检测、细胞壁成分检测、核酸检测以及质谱分析仪检测。由于非培养方法在灵敏度或特异性上存在一定缺陷，因此其始终不能完全代替培养鉴定方法。
1.1 显微镜直接镜检技术 直接镜检技术是检测白假丝酵母菌感染最基本的检验方法之一，其优点是不需要特殊的设备和试剂，容易开展，即简便、快速而且实用。直接镜检存在的缺点是主观因素导致假阴性或假阳性结果，阴性结果并不能排除白假丝酵母菌感染，阳性率相对较低，且不能直接用于菌种的鉴定[3]。不染色标本直接镜检：对于尿液、脓液及分泌物等标本直接取少量置载玻片上，加适量的生理盐水混匀即可直接镜检，对于皮屑、毛发及指甲等标本，需进行消化处理后，可在显微镜下观察孢子及菌丝体。染色标本显微镜检查：白假丝酵母菌经革兰氏或乳酸棉酚兰染色后，光镜下可见染成深紫色或蓝色的菌丝、孢子，熒光染色更适用于深部感染的白假丝酵母菌检查，在荧光显微镜下观察菌体成黄绿色，目前革兰染色法在临床上使用最为广泛，其不受温度影响，病原体长期固定在涂片上便于复查。
1.2 分离培养鉴定技术 培养基培养鉴定：白假丝酵母菌接种于人或动物血清中孵育后，光镜下孢子可长出细而短的小芽管。CHROMagar显色培养基上白假丝酵母菌呈现翠绿色。培养基培养技术可提高白假丝酵母菌的阳性检出率，同时还可以确定其种类，但培养的时间较长，培养阳性率也较低[4]。检测深部白假丝酵母菌感染的生化试验方法包括：糖类发酵试验、硝酸盐还原试验、尿素酶试验。对于特殊变异的菌株，生化试验鉴定存在一定的局限性。近年来，API 20C AUX等生化鉴定系统不断被开发出来，其正确鉴定率高，鉴定范围宽，但也存在价格昂贵，对无菌操作要求严格的缺点[5]。
1.3 血清学检测技术 目前国外报道检测白假丝酵母菌抗原的试剂普遍存在敏感性和特异性偏低的缺点，朱素梅等[6]研究结果表明该技术操作简便、快速，灵敏度比直接显微镜检测高，适合妇产科门诊大批量标本的筛查。检测特异性抗体及分泌蛋白酶虽然对判断预后和流行病学调查有所帮助，但是对深部白假丝酵母菌感染的确诊意义不大。检测1，3-β-D-葡聚糖是目前比较有发展空间的诊断方法，但对感染的特异性诊断存在局限性，只能作为筛查试验。总之，血清学检测试验存在一定假阴性和假阳性结果，而且检测试剂昂贵，国内尚未广泛使用。
1.4 组织病理学检测技术 通过组织或细胞化学方法在组织切片中找到病原菌-白假丝酵母菌，是确诊该菌感染的金标准[7]。但病理学传统的检测技术敏感性不高，并且存在侵入性操作，有增加感染等并发症的风险，因此不作为诊断白假丝酵母菌感染的首选方法。
1.5 动物接种实验 动物实验应用于白假丝酵母菌实验室诊断的目的是分离出致病菌，确定本菌种的致病性，研究药物对该病原菌的作用等。这种动物实验技术操作复杂繁琐、费时费力，目前只用于科学研究项目，并没有在临床工作中广泛应用。
1.6 核酸杂交检测技术 即用已知特定序列的标记探针与待检测核酸片段杂交，以检验其是否与已知的探针具有同源序列。李田等人[8]用该技术对假丝酵母菌进行检测，证实了核酸杂交的敏感度和特异性均高于传统检测方法，与金标准检测方法具有较好的一致性。
2 白假丝酵母菌基因分型检测技术
基因分型技术是以生物体DNA序列差异为基础建立起来的显示基因组多态性的检测方法。这些分子生物学检测技术具有敏感性高、特异性强、结果稳定可靠等优点，可以作为区分院内多重感染、微生物病原体分型鉴定、种群遗传关系和菌株间亲缘关系等深入研究的技术方法。
2.1 脉冲凝胶电泳核型(PFGE)检测技术 该技术分型能力较强，运用于大分子DNA分离具有良好的重复性和稳定性，适用于流行病学的调查研究[9]，基于PFGE技术的核型分析(EK)技术使得具有大分子量核酸的白假丝酵母菌基因组深入研究得以进行，但此类分型技术耗时长，易受多种因素影响，不能对分子量相近的DNA进行有效分离等[10]。
2.2 多位点酶电泳(MLEE)检测技术 通过检测酶蛋白的多态性来反映基因位点的多态性，是白假丝酵母菌流行病学研究中应用最早的基因分型方法，MLEE具有重复性极佳的优点[11]，但其检测耗时较长，分型分辨率一般，且不能检测全部基因序列，需多个酶切位点结合以提高灵敏度。, 百拇医药(覃羽华)
中图分类号：R446.5 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.05.017
白假丝酵母菌(candida albicans)俗称白色念珠菌，在一定条件下可侵犯皮肤、黏膜、内脏和血液，引起继发性感染，表现为急性、亚急性或慢性炎症。近年来，医学诊断和治疗技术的迅猛发展，使得各种危重症患者的病死率有所下降，与此同时各种新医疗技术越来越多地被应用，以及免疫缺陷患者增多，人口老龄化日益加剧，条件致病性真菌引发的深部真菌性疾病发生率愈来愈高，严重威胁着患者的身体健康和生命安全，受到医学界的高度重视[1]。对人类致病的深部真菌病原菌主要有假丝酵母菌属、酵母菌属以及曲霉菌属，其中，白假丝酵母菌引起的真菌感染是最常见的一种，有研究表明，在亚洲白假丝酵母菌引起深部真菌病的病死率高达30.0%左右[2]。以往针对白假丝酵母菌传统的分类系统研究方法，如形态学法、生物学法、组织发生学法、血清学法以及药敏谱类型分析等存在区分率较低，易受外环境影响，重复性、精准性较差的缺点，已不能对其进行更深入而有效的分析与研究。目前，随着生命科学及医疗科技的发展，以PCR为基本原理的分子生物学技术以及更高端精准的微生物质谱分析技术已逐步应用于医学研究领域，解决了一些传统检测技术不能解决的问题。现将白假丝酵母菌临床检测及分型技术的研究进展综述如下。
1 白假丝酵母菌检测技术
白假丝酵母菌的基本检测技术包括培养方法和非培养方法，培养方法可分为大培养和小培养两种;非培养方法则包括：显微镜检查、抗原抗体和特异性代谢产物检测、细胞壁成分检测、核酸检测以及质谱分析仪检测。由于非培养方法在灵敏度或特异性上存在一定缺陷，因此其始终不能完全代替培养鉴定方法。
1.1 显微镜直接镜检技术 直接镜检技术是检测白假丝酵母菌感染最基本的检验方法之一，其优点是不需要特殊的设备和试剂，容易开展，即简便、快速而且实用。直接镜检存在的缺点是主观因素导致假阴性或假阳性结果，阴性结果并不能排除白假丝酵母菌感染，阳性率相对较低，且不能直接用于菌种的鉴定[3]。不染色标本直接镜检：对于尿液、脓液及分泌物等标本直接取少量置载玻片上，加适量的生理盐水混匀即可直接镜检，对于皮屑、毛发及指甲等标本，需进行消化处理后，可在显微镜下观察孢子及菌丝体。染色标本显微镜检查：白假丝酵母菌经革兰氏或乳酸棉酚兰染色后，光镜下可见染成深紫色或蓝色的菌丝、孢子，熒光染色更适用于深部感染的白假丝酵母菌检查，在荧光显微镜下观察菌体成黄绿色，目前革兰染色法在临床上使用最为广泛，其不受温度影响，病原体长期固定在涂片上便于复查。
1.2 分离培养鉴定技术 培养基培养鉴定：白假丝酵母菌接种于人或动物血清中孵育后，光镜下孢子可长出细而短的小芽管。CHROMagar显色培养基上白假丝酵母菌呈现翠绿色。培养基培养技术可提高白假丝酵母菌的阳性检出率，同时还可以确定其种类，但培养的时间较长，培养阳性率也较低[4]。检测深部白假丝酵母菌感染的生化试验方法包括：糖类发酵试验、硝酸盐还原试验、尿素酶试验。对于特殊变异的菌株，生化试验鉴定存在一定的局限性。近年来，API 20C AUX等生化鉴定系统不断被开发出来，其正确鉴定率高，鉴定范围宽，但也存在价格昂贵，对无菌操作要求严格的缺点[5]。
1.3 血清学检测技术 目前国外报道检测白假丝酵母菌抗原的试剂普遍存在敏感性和特异性偏低的缺点，朱素梅等[6]研究结果表明该技术操作简便、快速，灵敏度比直接显微镜检测高，适合妇产科门诊大批量标本的筛查。检测特异性抗体及分泌蛋白酶虽然对判断预后和流行病学调查有所帮助，但是对深部白假丝酵母菌感染的确诊意义不大。检测1，3-β-D-葡聚糖是目前比较有发展空间的诊断方法，但对感染的特异性诊断存在局限性，只能作为筛查试验。总之，血清学检测试验存在一定假阴性和假阳性结果，而且检测试剂昂贵，国内尚未广泛使用。
1.4 组织病理学检测技术 通过组织或细胞化学方法在组织切片中找到病原菌-白假丝酵母菌，是确诊该菌感染的金标准[7]。但病理学传统的检测技术敏感性不高，并且存在侵入性操作，有增加感染等并发症的风险，因此不作为诊断白假丝酵母菌感染的首选方法。
1.5 动物接种实验 动物实验应用于白假丝酵母菌实验室诊断的目的是分离出致病菌，确定本菌种的致病性，研究药物对该病原菌的作用等。这种动物实验技术操作复杂繁琐、费时费力，目前只用于科学研究项目，并没有在临床工作中广泛应用。
1.6 核酸杂交检测技术 即用已知特定序列的标记探针与待检测核酸片段杂交，以检验其是否与已知的探针具有同源序列。李田等人[8]用该技术对假丝酵母菌进行检测，证实了核酸杂交的敏感度和特异性均高于传统检测方法，与金标准检测方法具有较好的一致性。
2 白假丝酵母菌基因分型检测技术
基因分型技术是以生物体DNA序列差异为基础建立起来的显示基因组多态性的检测方法。这些分子生物学检测技术具有敏感性高、特异性强、结果稳定可靠等优点，可以作为区分院内多重感染、微生物病原体分型鉴定、种群遗传关系和菌株间亲缘关系等深入研究的技术方法。
2.1 脉冲凝胶电泳核型(PFGE)检测技术 该技术分型能力较强，运用于大分子DNA分离具有良好的重复性和稳定性，适用于流行病学的调查研究[9]，基于PFGE技术的核型分析(EK)技术使得具有大分子量核酸的白假丝酵母菌基因组深入研究得以进行，但此类分型技术耗时长，易受多种因素影响，不能对分子量相近的DNA进行有效分离等[10]。
2.2 多位点酶电泳(MLEE)检测技术 通过检测酶蛋白的多态性来反映基因位点的多态性，是白假丝酵母菌流行病学研究中应用最早的基因分型方法，MLEE具有重复性极佳的优点[11]，但其检测耗时较长，分型分辨率一般，且不能检测全部基因序列，需多个酶切位点结合以提高灵敏度。, 百拇医药(覃羽华)