微柱凝胶法在血型鉴定和交叉配血中的应用
(江西省上高县人民医院检验科江西上高336400)【摘要】目的 探讨微柱凝胶技术在血型鉴定和交叉配血中的应用。 方法 应用微柱凝胶法和传统试管法进行血型鉴定4630例,交叉配血1760例。结果 微柱凝胶法和传统试管法血型鉴定不一致3例。交叉配血受冷凝集素影响2例，次侧不合1例。结论 微柱凝胶试验可作为血型和交叉配血的常规检测方法。【中图分类号】R446.6【文献标识码】A【文章编号】1004-5511(2012)04-0057-01 血型鉴定在急诊抢救、手术治疗、贫血治疗、刑事鉴定等过程中是不可缺少的检验，它的正确与否关系到病人生命安危。目前国内各级医院血型鉴定绝大多数都是手工操作，而且在一般情况下仅做正向定型法。由于手工操作不易标准化，且干扰因素较多，血型错检时有发生。因此，为了确保血型的准确性，实行血型鉴定的标准化，我科血库自2010年9月开始采用微柱凝胶法和传统试管法进行血型鉴定4630例，微柱凝胶法交叉配血1760例，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 仪器 孵育器：长春博研专用孵育器；离心机：长春博研专用离心机；移液器：1μl、50μl、50μl和1000μl。
1.2 试剂:(1) 仪器试剂 长春博讯生物微柱凝胶血型鉴定卡，不规则抗体检测卡；(2)手工试剂 抗A、抗B血清为上海血液生物医药有限公司生产，生产批号20100310，单克隆抗D为长春博德生物技术有限公司生产，生产批号1929040
1.3
标本来源 2010年9月起我院住院和门诊送检血型4630例，交叉配血1760例，抽取病人静脉血2ml，EDTA抗凝。
1.4 方法:(1)微柱凝胶检测法按长春博讯微柱凝胶血型鉴定和不规则抗体检测说明书进行：取ABO/Rh血型鉴定卡一个，在空白位置写上病人姓名，病历号等，撕去卡上部的锡纸膜。 在A、B、D孔分别加入已配制的0.5%病人红细胞悬液50μl。专用离心机离心。离心完成后取出卡片按说明书提示标准判读结果。 取不规则抗体检测卡一个，在空白位置写上病人姓名，病历号等，撕去卡上部的锡纸膜。主侧加入供血者0.5%红细胞悬液次管50μl和受血者血浆50μl，次侧加入0.5%病人红细胞悬液50μl和供血者血浆50μl，专用离心机离心。离心完成后取出卡片按说明书提示标准判读结果。(2) 手工操作正向定型试管法按《全国临床检验操作规程》规定进行。2 结果2.1 血型鉴定 共4630例 微柱凝胶法和传统试管法不一致3例(其中两例为0~6月婴儿)。2.2 交叉配血 共1760例 其中主侧良好，次侧凝集一例，在微柱中仅加入受血者0.5%红细胞悬液50μl，孵育后离心，结果显示阳性。冷凝集素影响交叉配血的2例，这2例中主、次侧微柱均出现不同程度的弱凝集，把这些卡放在37℃孵育器孵育15 min后离心，凝集有不同程度的减弱。
3 讨论
《全国临床检验操作规程》[1]对血型鉴定要求同时通过正、反向定型来准确鉴定ABO血型，并规定操作中红细胞悬液的浓度、加样的顺序、试剂用量、离心速度、时间等。但目前国内大多数医院血型鉴定均只采用正向定型法，省略了反向定型，且操作较随意，难以标准化，故易导致血型错检的发生。
微柱凝胶试验是法国Dr.Yves Lapierre在1986年首先发明的一项免疫学检测新技术，是微柱凝胶技术与以往所有血型鉴定技术相结合的产物。1994年此项技术获得了美国FDA的认可。经过不断改进和临床大量应用，目前，在多数发达国家，此项技术已作为常规的红细胞血型血清学检测技术应用于临床[2-5]。
微柱凝胶检测法是抗原抗体反应与凝胶分子筛技术相结合的产物。通过调节葡聚糖凝胶的浓度来控制分子筛孔径大小，使分子筛只允许游离分子通过，从而达到分离凝集红细胞和游离红细胞的目的。即将红细胞和血清加在凝胶的上部反应离心以后，凝集红细胞将受到凝胶的阻碍而停留在凝胶的上部或凝胶中，则证明发生凝集反应为阳性，反之，所有红细胞都停留在凝胶底部，证明未发生凝集反应，则可判为凝集反应阴性。
在4630例血型鉴定中，微柱凝胶法与传统试管法不一致3例，其中2例年龄小于6月，一例为抗凝效果不佳至微柱凝胶法假阳性。新生儿及部分老年人RBC抗原较青壮年弱，一些白血病或恶性肿瘤也会使RBC抗原变弱，在手工操作鉴定时，凝集较弱难以判别血型。而微柱凝胶检测法，分离柱中的凝胶孔隙大小只让未凝集的RBC通过，而凝集的RBC则被阻碍于分离柱外，使检测具有较高的灵敏性[6-8]。
某些自身免疫性疾病或新生儿溶血病患者的RBC会自发的发生凝集，另外，如果RBC膜有遗传性或获得性异常，也易发生凝集，在人工血型正定型中，出现假凝集易造成血型错检。微柱凝胶法中加入了抗人球蛋白，以促进红细胞的特异性凝集，因此，特异性高于手工正定型法。在血型鉴定中遇到纤维蛋白含量过高影响配血结果，是由于患者血液标本抗凝效果不佳，内含不易察觉的纤维蛋白出现细胞凝块，这种假凝集程度一般较弱，黏附一定量红细胞的纤维蛋白大多聚集在微柱的最上层，但颜色较淡，而大部分红细胞则沉积到微柱的底端，这种情况一般不难判断。因此为了防止血液凝固给试验带来不良影响，患者血液抽出后应立即注入抗凝管，并充分摇匀。
微柱凝胶法交叉配血1例主侧良好，次侧凝集，用凝集胺法交叉配血主侧良好，次侧凝集。在微柱中仅加入受血者0.5%红细胞悬液50μl，孵育后离心，结果显示阳性，患者为男性，诊断为自身免疫性溶血，因患者无输血史，考虑为自身抗体至交叉配血次侧凝集。冷凝集素影响交叉配血的2例，这2例中主、次侧微柱均出现不同程度的弱凝集把这些卡放在37℃孵育器孵育15 min后离心，凝集有不同程度的减弱或消失。
微柱凝胶检测法采用标准化定量操作，最大限度减少操作人员的随意性，重复性好，由于采用了凝胶分子筛技术，将凝集红细胞与游离红细胞分离开，使结果一目了然，避免了镜下的主观影响。所需标本量少，约为手工法用量的1/2~1/4，尤其适用于新生儿、大面积烧伤等标本不易抽取的患者。操作简便，省去繁琐的洗涤过程，不再担心抗人球蛋白抗体被中和而产生假阴性。便于保存，一般置室温可保存数月至1年，还可进行拍照摄像提供永久记录，以备发生血型鉴定差错时查找原始资料。塑料卡易于销毁。
红细胞浓度过低或过高或离心不彻底，血清中含纤维蛋白、出现细胞“凝块”、细菌污染等，可能导致微柱凝胶检测法呈假阴性或假阳性[9]。因此，准确的细胞浓度是微柱凝胶检测法正确操作的关键之一。
微柱凝胶检测法在实验前应将新卡离心，以使微柱内壁上端沾有的凝胶离心下来，以免撕膜时各微柱内容物交叉污染。撕开卡上部的锡纸膜时，注意避免各微柱间特异性单克隆抗体的交叉污染。在使用加样枪或移液器时，应将红细胞悬液或血清悬空加入各微柱上端，避免一切交叉污染。加入的红细胞悬液或血清如果没有刚好加在微柱凝胶上部或两者之间有气柱，可在离心后消除，不影响试验结果。
综上所述，微柱凝胶检测法对提高血型鉴定检验质量与水平有明显的促进作用，故它在临床上的应用必将得到进一步的推广。参考文献[1]叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程[M].第2版.南京：东南大学出版社，1997:89-91
[2]李勇，杨贵贞.人类红细胞血型学使用理论与实验技术[M].北京：中国科学技术出版社，1999:276-278
[3]Titlestd K,Georgsen J,Andersen H,et al.Detection of irregular red cell antibodies:more than 3 years of experience with a gel technique and pooled screening cells[J].Vox Sang,1997,73 (4):246
[4]Langston MM,Procter JL,Cipolone KM,et al.Evaluation of the gel system for ABO grouping and D typing[J].Transfusion,1999,39(3):300
[5]Cate JC 4th,Reilly N.Evaluation and implementation of the gel test for indirect antiglobulin testing in a community hospital laboratory[J].Arch Pathol Lab Med,1999,123(8):693
[6]邹文.柱凝胶法快速检出抗-E所致配血不合1例报道[J].四川省卫生管理干部学院学报，2000，19(4)：278
[7]文翠容，李娅，冯艳青，等.卡式检测法快速检出抗-E所致配血不合1例[J].2002，27(7)：579
[8]孙福廷，李新菊，王金萍，等.IgG抗-e引起卡式配血不合1例[J].实用医药杂志，2004，21(7)：644
[9]彭道波，兰炯采，王梁平，等.用微柱凝胶试验进行交叉配血[J].中国输血杂志，2001，14(4)：232, 百拇医药(陈青根 黄丽华)
1 材料与方法
1.1 仪器 孵育器：长春博研专用孵育器；离心机：长春博研专用离心机；移液器：1μl、50μl、50μl和1000μl。
1.2 试剂:(1) 仪器试剂 长春博讯生物微柱凝胶血型鉴定卡，不规则抗体检测卡；(2)手工试剂 抗A、抗B血清为上海血液生物医药有限公司生产，生产批号20100310，单克隆抗D为长春博德生物技术有限公司生产，生产批号1929040
1.3
标本来源 2010年9月起我院住院和门诊送检血型4630例，交叉配血1760例，抽取病人静脉血2ml，EDTA抗凝。
1.4 方法:(1)微柱凝胶检测法按长春博讯微柱凝胶血型鉴定和不规则抗体检测说明书进行：取ABO/Rh血型鉴定卡一个，在空白位置写上病人姓名，病历号等，撕去卡上部的锡纸膜。 在A、B、D孔分别加入已配制的0.5%病人红细胞悬液50μl。专用离心机离心。离心完成后取出卡片按说明书提示标准判读结果。 取不规则抗体检测卡一个，在空白位置写上病人姓名，病历号等，撕去卡上部的锡纸膜。主侧加入供血者0.5%红细胞悬液次管50μl和受血者血浆50μl，次侧加入0.5%病人红细胞悬液50μl和供血者血浆50μl，专用离心机离心。离心完成后取出卡片按说明书提示标准判读结果。(2) 手工操作正向定型试管法按《全国临床检验操作规程》规定进行。2 结果2.1 血型鉴定 共4630例 微柱凝胶法和传统试管法不一致3例(其中两例为0~6月婴儿)。2.2 交叉配血 共1760例 其中主侧良好，次侧凝集一例，在微柱中仅加入受血者0.5%红细胞悬液50μl，孵育后离心，结果显示阳性。冷凝集素影响交叉配血的2例，这2例中主、次侧微柱均出现不同程度的弱凝集，把这些卡放在37℃孵育器孵育15 min后离心，凝集有不同程度的减弱。
3 讨论
《全国临床检验操作规程》[1]对血型鉴定要求同时通过正、反向定型来准确鉴定ABO血型，并规定操作中红细胞悬液的浓度、加样的顺序、试剂用量、离心速度、时间等。但目前国内大多数医院血型鉴定均只采用正向定型法，省略了反向定型，且操作较随意，难以标准化，故易导致血型错检的发生。
微柱凝胶试验是法国Dr.Yves Lapierre在1986年首先发明的一项免疫学检测新技术，是微柱凝胶技术与以往所有血型鉴定技术相结合的产物。1994年此项技术获得了美国FDA的认可。经过不断改进和临床大量应用，目前，在多数发达国家，此项技术已作为常规的红细胞血型血清学检测技术应用于临床[2-5]。
微柱凝胶检测法是抗原抗体反应与凝胶分子筛技术相结合的产物。通过调节葡聚糖凝胶的浓度来控制分子筛孔径大小，使分子筛只允许游离分子通过，从而达到分离凝集红细胞和游离红细胞的目的。即将红细胞和血清加在凝胶的上部反应离心以后，凝集红细胞将受到凝胶的阻碍而停留在凝胶的上部或凝胶中，则证明发生凝集反应为阳性，反之，所有红细胞都停留在凝胶底部，证明未发生凝集反应，则可判为凝集反应阴性。
在4630例血型鉴定中，微柱凝胶法与传统试管法不一致3例，其中2例年龄小于6月，一例为抗凝效果不佳至微柱凝胶法假阳性。新生儿及部分老年人RBC抗原较青壮年弱，一些白血病或恶性肿瘤也会使RBC抗原变弱，在手工操作鉴定时，凝集较弱难以判别血型。而微柱凝胶检测法，分离柱中的凝胶孔隙大小只让未凝集的RBC通过，而凝集的RBC则被阻碍于分离柱外，使检测具有较高的灵敏性[6-8]。
某些自身免疫性疾病或新生儿溶血病患者的RBC会自发的发生凝集，另外，如果RBC膜有遗传性或获得性异常，也易发生凝集，在人工血型正定型中，出现假凝集易造成血型错检。微柱凝胶法中加入了抗人球蛋白，以促进红细胞的特异性凝集，因此，特异性高于手工正定型法。在血型鉴定中遇到纤维蛋白含量过高影响配血结果，是由于患者血液标本抗凝效果不佳，内含不易察觉的纤维蛋白出现细胞凝块，这种假凝集程度一般较弱，黏附一定量红细胞的纤维蛋白大多聚集在微柱的最上层，但颜色较淡，而大部分红细胞则沉积到微柱的底端，这种情况一般不难判断。因此为了防止血液凝固给试验带来不良影响，患者血液抽出后应立即注入抗凝管，并充分摇匀。
微柱凝胶法交叉配血1例主侧良好，次侧凝集，用凝集胺法交叉配血主侧良好，次侧凝集。在微柱中仅加入受血者0.5%红细胞悬液50μl，孵育后离心，结果显示阳性，患者为男性，诊断为自身免疫性溶血，因患者无输血史，考虑为自身抗体至交叉配血次侧凝集。冷凝集素影响交叉配血的2例，这2例中主、次侧微柱均出现不同程度的弱凝集把这些卡放在37℃孵育器孵育15 min后离心，凝集有不同程度的减弱或消失。
微柱凝胶检测法采用标准化定量操作，最大限度减少操作人员的随意性，重复性好，由于采用了凝胶分子筛技术，将凝集红细胞与游离红细胞分离开，使结果一目了然，避免了镜下的主观影响。所需标本量少，约为手工法用量的1/2~1/4，尤其适用于新生儿、大面积烧伤等标本不易抽取的患者。操作简便，省去繁琐的洗涤过程，不再担心抗人球蛋白抗体被中和而产生假阴性。便于保存，一般置室温可保存数月至1年，还可进行拍照摄像提供永久记录，以备发生血型鉴定差错时查找原始资料。塑料卡易于销毁。
红细胞浓度过低或过高或离心不彻底，血清中含纤维蛋白、出现细胞“凝块”、细菌污染等，可能导致微柱凝胶检测法呈假阴性或假阳性[9]。因此，准确的细胞浓度是微柱凝胶检测法正确操作的关键之一。
微柱凝胶检测法在实验前应将新卡离心，以使微柱内壁上端沾有的凝胶离心下来，以免撕膜时各微柱内容物交叉污染。撕开卡上部的锡纸膜时，注意避免各微柱间特异性单克隆抗体的交叉污染。在使用加样枪或移液器时，应将红细胞悬液或血清悬空加入各微柱上端，避免一切交叉污染。加入的红细胞悬液或血清如果没有刚好加在微柱凝胶上部或两者之间有气柱，可在离心后消除，不影响试验结果。
综上所述，微柱凝胶检测法对提高血型鉴定检验质量与水平有明显的促进作用，故它在临床上的应用必将得到进一步的推广。参考文献[1]叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程[M].第2版.南京：东南大学出版社，1997:89-91
[2]李勇，杨贵贞.人类红细胞血型学使用理论与实验技术[M].北京：中国科学技术出版社，1999:276-278
[3]Titlestd K,Georgsen J,Andersen H,et al.Detection of irregular red cell antibodies:more than 3 years of experience with a gel technique and pooled screening cells[J].Vox Sang,1997,73 (4):246
[4]Langston MM,Procter JL,Cipolone KM,et al.Evaluation of the gel system for ABO grouping and D typing[J].Transfusion,1999,39(3):300
[5]Cate JC 4th,Reilly N.Evaluation and implementation of the gel test for indirect antiglobulin testing in a community hospital laboratory[J].Arch Pathol Lab Med,1999,123(8):693
[6]邹文.柱凝胶法快速检出抗-E所致配血不合1例报道[J].四川省卫生管理干部学院学报，2000，19(4)：278
[7]文翠容，李娅，冯艳青，等.卡式检测法快速检出抗-E所致配血不合1例[J].2002，27(7)：579
[8]孙福廷，李新菊，王金萍，等.IgG抗-e引起卡式配血不合1例[J].实用医药杂志，2004，21(7)：644
[9]彭道波，兰炯采，王梁平，等.用微柱凝胶试验进行交叉配血[J].中国输血杂志，2001，14(4)：232, 百拇医药(陈青根 黄丽华)
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