克雷伯氏菌菌株ZD112的菊酯农药降解酶特性研究(2)
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参见附件(1784KB，2页)。
1.7 酶的pH稳定性：同上配制pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0的50 mM的广泛缓冲液，将酶液分别加入到上述缓冲液中，42℃保温1 h后，按标准酶活力测定方法测定残余酶活力，以在最适反应pH下测得的酶活力定为100 %。以相对活力对所对应的pH值作图。
1.8酶的最适反应温度：将酶液和0.02M、pH6.2的磷酸盐缓冲液分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的不同温度的水浴中保温30 min，然后加入底物溶液按照标准方法测定酶活力，得到酶液在不同的反应温度下所具有的酶活力，以酶活力最高者定为100 %，以相对活力对温度作图。
1.9 酶的热稳定性：酶液分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的水浴中保温1h后，然后加入底物溶液按照标准方法测定残余酶活力，以未处理酶液的酶活定为100 %。以相对活力对保温时间作图。
1.10粗酶液中可溶性蛋白含量的测定：蛋白质含量测定，用Beckman蛋白核酸分析仪测定粗酶液中可溶性蛋白含量(OD280) 。
2结果
2.1菌株Klebsiella sp.ZD112的降解底物谱研究。菌株Klebsiella sp.ZD112对各种菊酯类农药都有比较好的降解能力(表1),特别是对氯氰菊酯、甲氰菊酯的降解作用非常明显,而对氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯的降解作用不太明显,这可能菊酯类农药的化学结构不同所形成的。
表1 菌株Klebsiella sp. ZD112的降解底物谱研究
2.2 酶活性的定位：氯氰菊酯水解酶活性组分的定位是通过收集完整细胞、破碎细胞，然后分别测定细胞和上清的酶活力确定的。以完整细胞的酶活力为100 %，计算各组分的相对活力。结果表明，培养液的上清没有酶活性，说明菌株Klebsiella sp.ZD112产生的水解酶位于细胞内(表2)。
2.3酶反应的最适pH。实验结果表明，该酶的适宜pH范围在6.0~7.5之间,降解率都在80 %以上, 最适反应pH是6.5(图1)。
图1pH对Klebsiella sp.ZD112的氯氰菊酯水解酶的活性和稳定性的影响
( □表示活性，●代表稳定性 )
2.4酶在不同pH条件下的稳定性：酶在pH6.0~7.5范围内，42℃处理1 h后，仍保持酶活力达80 %以上，酶在偏酸性环境下较为稳定，结果(图1)。
2.5 酶的最适反应温度：该酶的适宜温度是40℃-55℃,最适反应温度是45℃(图2)。
图 2温度对Klebsiella sp.ZD112的氯氰菊酯水解酶的活性和稳定性的影响
( □表示活性，●代表稳定性 )
2.6 酶的热稳定性：酶的热稳定性测定结果表明(图2)，酶在45℃以下稳定性良好，50℃、60℃、70℃下保温lh，酶活力随着温度的升高而下降加剧，70℃下剩余最高酶活的12 %左右。
2.7粗酶液中可溶性蛋白含量的测定：粗酶液中可溶性蛋白含量的测定结果表明，粗酶液中可溶性蛋白含量为0.365 mg/ml。
2.8酶的动力学常数测定：经粗提酶的米氏常数Km和最大反应速率测定，做出酶对氯氰菊酯的Lineweaver-Burk图(图3)。其反应速率倒数(y)与底物浓度倒数(x)的线性方程为y = 0.0892x + 0.0087。因此酶对氯氰菊酯的米氏常数Km= 10.25μM，最大反应速率Vmax= 114.94μM/min。
图3菌株ZD112水解酶的Lineweaver-Burk图
3讨论
由于农药的微生物降解实质上就是酶促降解，而且酶可以在常温、常压等温和的反应条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也能顺利完成。因此从微生物中提取降解酶并在室内纯培养条件下研究菌株适宜的产酶条件，酶的提取纯化条件、粗酶液及纯酶的温度、pH稳定性及保持其降解活性的最适条件,对于农药降解酶的开发利用打下了很好的理论基础。
Klebsiella sp. ZD112产生的菊酯类农药降解酶具有较宽的pH适应范围和较好的热稳定性 ......
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