五苓散对脑出血大鼠TNF-α表达的影响
[摘 要]目的 研究大鼠实验性脑出血后血肿周围肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达及五苓散汤剂对TNF-α的影响。方法 采用自体不凝血注入大鼠尾状核制备脑出血模型，免疫组化染色法检测脑组织TNF-α的表达。结果 脑出血后6小时血肿周围脑组织TNF-α开始表达，48小时达高峰，7天显著下降；五苓散组与模型组之间有显著差异(均 P<0.05)。而TNF-α的表达与脑含水量之间存在正相关(P <0.05)。结论 TNF-α参与了脑出血继发性脑组织损伤，并与损伤程度存在相关性，五苓散可能通过减轻脑水肿，减少TNF-α的产生发挥脑保护作用。
关键词：五苓散 脑出血 肿瘤坏死因子-α 脑水肿
中图分类号：R743.34 文献标识码：A 文章编号：1005-0019(2008)4-0050-02
脑出血是临床常见的急危重症，脑水肿和继发脑损伤是脑出血高病死率、高致残率的重要原因。五苓散组方为猪苓12g，泽泻15g，白术15g，茯苓12g，桂枝9g，主要为人体水液运行失常而设，功用为利水渗湿，温阳化气。刘氏[1]等证实了其具有改善脑水肿及保护血脑屏障的功能等作用。本研究采用大鼠实验性脑出血模型，观察大鼠脑出血后血肿周围脑组织炎症细胞因子肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor alpha，TNF-α)水平及含水量变化，以及五苓散对脑出血大鼠干预后上述指标的变化，探讨大鼠脑出血后脑组织炎性损害及五苓散的保护作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试验动物SD雄性大鼠90只，体重：200～250克。五苓散按照人鼠对照比例配制成汤剂。一抗：肿瘤坏死因子(TNF-α)，即用型SABC免疫组化染色试剂盒。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与给药： 70只大鼠随机分出假手术组(颅内注射120ul生理盐水，普通饲养，蒸馏水灌胃)10只，。模型组(造模，蒸馏水灌胃)30只、中药组(造模，每天用汤剂1.6g/ml灌胃，相当于成人70kg体重的3倍)30只；每组再随机分为术后6h、24h、2d、3d、7d 5个时间点，均为术后麻醉清醒后开始灌胃给药，每日2次，每次2ml。进行神经症状计分后，做脑含水量测定、内固定脑切片。
1.2.2 制造自体血注入脑出血大鼠动物模型。大鼠麻醉后，脱毛，调整脑立体定向仪，按《大鼠脑立体定向图谱》[2]确定左侧尾状核的坐标值，在大鼠颅骨上相应点钻一小孔，将固定在定向仪上的针头经此孔插人左侧尾状核处。收集鼠尾新鲜血液，注入120ul后退出注射针头[3]。
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1.2.3 模型成功的评分：按 Bederson评定方法：I级：将大鼠尾巴提起瘫痪侧前肢回收屈曲于腹下，正常侧前肢向地面伸展；Ⅱ级：除I级体征外向瘫痪侧推大鼠时阻力较对侧明显降低；Ⅲ级：除以上体征外大鼠有向瘫痪侧旋转的行为。
1.2.4 免疫组织化学技术按ABC试剂盒说明书进行，石蜡切片脱蜡至水，微波消化13min。3%H2O2室温孵育10min。滴加10%正常山羊血清封闭液，室温下10min。滴加1：100兔抗鼠多克隆抗体，4℃过夜。滴加二抗，37℃孵育30分钟。滴加ABC复合物，室温30min。各步骤间PBS洗三次，每次5min。DAB显色，光镜下观察苏木素轻度复染，蒸馏水冲洗。常规脱水，透明，封片。
1.2.5 阳性细胞记数：每只大鼠择优选一张脑切片，在 400倍光镜下选取血肿区的5个视野，每个时间点共计l5个视野，计数其中每个视野的TNF-α阳性细胞数，取均值作为各组每个时间点TNF-α阳性细胞数。
, 百拇医药
1.2.6 脑组织含水量测定：采用干湿法。电子天平称湿重，然后置于电热恒温烤箱，105℃24h烤至恒重。按Elliott公式计算：含水量=(湿重-干重)/湿重*100%。
1.3 统计学分析
应用SPSS11.5统计软件包对数据进行处理。各组实验值以均数±标准差(X±s)表示，计量资料两组间比较用t检验，同组不同指标之间用相关性分析，检验水准 P=0.05。
2 结果
2.1 大鼠70只，在实验过程中有1只大鼠未达观察时点死亡；脑出血对照组和五苓散治疗组有3只大鼠造模未成功，均被排除实验，用备用大鼠进行随机补充，保证数量不变。
2.2 脑出血对照组与五苓散治疗组TNF-α阳性细胞数比较有显著差异，P<0.05。
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2.3 脑出血对照组与五苓散治疗组血肿周围脑组织含水量比较有显著差异，P<0.05。
2.4 脑出血对照组各时点血肿周围脑组织含水量与相应脑组织TNF-α水平呈正相关 (r=0.5410，P<0.05)，五苓散治疗组各时点脑组织含水量与相应脑组织TNF-α水平也呈正相关 (r=0.548，P<0.05)。
3 讨论
大鼠肿瘤坏死因子α是一种重要的免疫调节和炎性因子，可增加血管内皮细胞通透性，发挥对血脑屏障的破坏作用，诱发或加重脑水肿。本实验通过在大鼠脑出血模型中抑制TNF-α的表达，得出对脑组织起到保护作用的结果，进一步证明了TNF-α在脑出血后的致炎症作用。
观五苓散正是通过利水渗湿，温阳化气，分三焦而治，为水液运行失常的主方。与使用甘露醇脱水降颅压，也许有异曲同工之效。本实验表明，模型组和五苓散治疗组大鼠在脑出血后48h的TNF-α阳性细胞数均达高峰，此后逐渐下降，至第 7h TNF-α阳性细胞数明显下降。在出血后第24h、2d、3d、7d四个时间点五苓散治疗组的TNF-α阳性细胞数均高于模型组。在出血后第24h、2d、3d三个时间点五苓散治疗组的脑含水量均低于模型组。以上结果提示五苓散可以减轻脑水肿，抑制脑出血大鼠脑内TNF-α表达，并且可能通过减少TNF-α的表达在脑出血损伤中发挥抗炎症损伤、抗缺血神经元损伤、促神经细胞再生等神经保护和神经营养作用，这可能是其疗效机制的重要组成部分。
本研究采用大鼠尾部血注入脑内制作脑出血模型，如用动脉血注入，则更贴近人类脑出血的病理生理状况，有待进一步完善。
参考文献
[1] 刘泰.健神利水1号对血管源性脑水肿影响的实验研究[J].广西中医药，2002，6(25)：8～10.
[2] 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M].第1版.北京：人民卫生出版社，1991，1.
[3] 任泽光，吴建中.大鼠脑出血模型[J].中华神经外科杂志，1993，9(4)：205～207., 百拇医药(张 静 王桂敏)
关键词：五苓散 脑出血 肿瘤坏死因子-α 脑水肿
中图分类号：R743.34 文献标识码：A 文章编号：1005-0019(2008)4-0050-02
脑出血是临床常见的急危重症，脑水肿和继发脑损伤是脑出血高病死率、高致残率的重要原因。五苓散组方为猪苓12g，泽泻15g，白术15g，茯苓12g，桂枝9g，主要为人体水液运行失常而设，功用为利水渗湿，温阳化气。刘氏[1]等证实了其具有改善脑水肿及保护血脑屏障的功能等作用。本研究采用大鼠实验性脑出血模型，观察大鼠脑出血后血肿周围脑组织炎症细胞因子肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor alpha，TNF-α)水平及含水量变化，以及五苓散对脑出血大鼠干预后上述指标的变化，探讨大鼠脑出血后脑组织炎性损害及五苓散的保护作用。
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1 材料与方法
1.1 试验动物SD雄性大鼠90只，体重：200～250克。五苓散按照人鼠对照比例配制成汤剂。一抗：肿瘤坏死因子(TNF-α)，即用型SABC免疫组化染色试剂盒。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与给药： 70只大鼠随机分出假手术组(颅内注射120ul生理盐水，普通饲养，蒸馏水灌胃)10只，。模型组(造模，蒸馏水灌胃)30只、中药组(造模，每天用汤剂1.6g/ml灌胃，相当于成人70kg体重的3倍)30只；每组再随机分为术后6h、24h、2d、3d、7d 5个时间点，均为术后麻醉清醒后开始灌胃给药，每日2次，每次2ml。进行神经症状计分后，做脑含水量测定、内固定脑切片。
1.2.2 制造自体血注入脑出血大鼠动物模型。大鼠麻醉后，脱毛，调整脑立体定向仪，按《大鼠脑立体定向图谱》[2]确定左侧尾状核的坐标值，在大鼠颅骨上相应点钻一小孔，将固定在定向仪上的针头经此孔插人左侧尾状核处。收集鼠尾新鲜血液，注入120ul后退出注射针头[3]。
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1.2.3 模型成功的评分：按 Bederson评定方法：I级：将大鼠尾巴提起瘫痪侧前肢回收屈曲于腹下，正常侧前肢向地面伸展；Ⅱ级：除I级体征外向瘫痪侧推大鼠时阻力较对侧明显降低；Ⅲ级：除以上体征外大鼠有向瘫痪侧旋转的行为。
1.2.4 免疫组织化学技术按ABC试剂盒说明书进行，石蜡切片脱蜡至水，微波消化13min。3%H2O2室温孵育10min。滴加10%正常山羊血清封闭液，室温下10min。滴加1：100兔抗鼠多克隆抗体，4℃过夜。滴加二抗，37℃孵育30分钟。滴加ABC复合物，室温30min。各步骤间PBS洗三次，每次5min。DAB显色，光镜下观察苏木素轻度复染，蒸馏水冲洗。常规脱水，透明，封片。
1.2.5 阳性细胞记数：每只大鼠择优选一张脑切片，在 400倍光镜下选取血肿区的5个视野，每个时间点共计l5个视野，计数其中每个视野的TNF-α阳性细胞数，取均值作为各组每个时间点TNF-α阳性细胞数。
, 百拇医药
1.2.6 脑组织含水量测定：采用干湿法。电子天平称湿重，然后置于电热恒温烤箱，105℃24h烤至恒重。按Elliott公式计算：含水量=(湿重-干重)/湿重*100%。
1.3 统计学分析
应用SPSS11.5统计软件包对数据进行处理。各组实验值以均数±标准差(X±s)表示，计量资料两组间比较用t检验，同组不同指标之间用相关性分析，检验水准 P=0.05。
2 结果
2.1 大鼠70只，在实验过程中有1只大鼠未达观察时点死亡；脑出血对照组和五苓散治疗组有3只大鼠造模未成功，均被排除实验，用备用大鼠进行随机补充，保证数量不变。
2.2 脑出血对照组与五苓散治疗组TNF-α阳性细胞数比较有显著差异，P<0.05。
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2.3 脑出血对照组与五苓散治疗组血肿周围脑组织含水量比较有显著差异，P<0.05。
2.4 脑出血对照组各时点血肿周围脑组织含水量与相应脑组织TNF-α水平呈正相关 (r=0.5410，P<0.05)，五苓散治疗组各时点脑组织含水量与相应脑组织TNF-α水平也呈正相关 (r=0.548，P<0.05)。
3 讨论
大鼠肿瘤坏死因子α是一种重要的免疫调节和炎性因子，可增加血管内皮细胞通透性，发挥对血脑屏障的破坏作用，诱发或加重脑水肿。本实验通过在大鼠脑出血模型中抑制TNF-α的表达，得出对脑组织起到保护作用的结果，进一步证明了TNF-α在脑出血后的致炎症作用。
观五苓散正是通过利水渗湿，温阳化气，分三焦而治，为水液运行失常的主方。与使用甘露醇脱水降颅压，也许有异曲同工之效。本实验表明，模型组和五苓散治疗组大鼠在脑出血后48h的TNF-α阳性细胞数均达高峰，此后逐渐下降，至第 7h TNF-α阳性细胞数明显下降。在出血后第24h、2d、3d、7d四个时间点五苓散治疗组的TNF-α阳性细胞数均高于模型组。在出血后第24h、2d、3d三个时间点五苓散治疗组的脑含水量均低于模型组。以上结果提示五苓散可以减轻脑水肿，抑制脑出血大鼠脑内TNF-α表达，并且可能通过减少TNF-α的表达在脑出血损伤中发挥抗炎症损伤、抗缺血神经元损伤、促神经细胞再生等神经保护和神经营养作用，这可能是其疗效机制的重要组成部分。
本研究采用大鼠尾部血注入脑内制作脑出血模型，如用动脉血注入，则更贴近人类脑出血的病理生理状况，有待进一步完善。
参考文献
[1] 刘泰.健神利水1号对血管源性脑水肿影响的实验研究[J].广西中医药，2002，6(25)：8～10.
[2] 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M].第1版.北京：人民卫生出版社，1991，1.
[3] 任泽光，吴建中.大鼠脑出血模型[J].中华神经外科杂志，1993，9(4)：205～207., 百拇医药(张 静 王桂敏)
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