类风湿关节炎患者淋巴细胞协同刺激分子和活化标志的表达及意义(1)
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中图分类号：R593.22 文献标识码：B 文章编号：1004-7484(2010)12-0296-03
类风湿关节炎(RA)是以多关节滑膜慢性炎症导致滑膜成纤维母细胞增生、大量淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞浸润为特征的一种常见自身免疫性疾病。研究发现，淋巴细胞活性及其信息传递异常与RA的发生密切相关。我们采用流式细胞仪分析RA患者外周血和关节滑膜液淋巴细胞协同刺激分子CD28/B7(CD80或CD86)、CDl54(CD40L)/CD40和淋巴细胞活化标志CD25、人白细胞DR抗原(HLA-DR)的表达，以探讨这些指标在BA诊断和治疗中的应用价值。
1对象和方法
1.1对象：30例RA患者，女24例，男6例，年龄27~65岁，均符合1987，年美国风湿病协会修订的类风湿关节炎诊断标准，健康献血者20名，女16名，男4名，年龄23~55岁。均抽取空腹静脉血2ml，经EDTA-K2抗凝备用。另20例RA患者的关节滑膜液取自齐齐哈尔医学院附属第三医院骨科行膝关节置换或滑膜切除术者，女15例，男5例，年龄23~41岁。对照组的关节滑膜液取自因外伤截肢的10名正常人，两组年龄、性别差异无统计学意义。
1.2关节滑膜液淋巴细胞协同刺激分子和淋巴细胞活化标志的表达：均采用双色荧光标记，分别和100 µl 1×106/ml细胞数的关节滑膜液充分混匀，室温暗处反应15min，加0.5 ml PBS，充分混匀，24h内上流式细胞仪分析。
1.3流式细胞分析：FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)开机后以CaliBRITE 3荧光微球和FACSComp自动软件检查仪器灵敏度，并自动设定试验获取条件，包括光电倍增管(PMT)电压和荧光补偿等。用CellQuest软件对样本试验获取条件作进一步优化，并检测各组样本管，获取10000个细胞后，用Cell Quest软件分析各CD分子在淋巴细胞中免疫荧光阳性细胞的百分率。
1.4关节滑膜液淋巴细胞分离：关节滑膜液用20 1U/ml肝素抗凝，3 000r/min离心10min，弃上清液，淀物加PBS重悬，用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离制备淋巴细胞(1 500r/min离心15 min)，调整细胞浓度至1×106/ml，用于流式细胞仪检测，6h内完成。
1.5外周血淋巴细胞协同刺激分子的表达：采用双色荧光染色，在FALCON试管(美国BD公司)中加入20µl异硫氰基荧光素(FITC)标记的抗CD3单抗，藻红蛋白(PE)标记的抗CD28单抗或抗CDl54(CD40L)单抗。同样在FALCON试管中加20µ1 FITC标记的抗CDl9单抗，PE标记的抗CD80单抗或抗CD86单抗或抗CD40单抗及双色同型对照免疫球蛋白(均为美国BD公司产品)，分别与100µl抗凝血充分混匀，室温暗处反应15min。加1×FACS溶血素(美国BD公司)2m1，充分混匀，室温暗处反应10min。1 000r/min离心5 min，弃上清液，加PBS 2 m1，充分混匀。1 000r/min离心5min，弃上清液，加0.5血PBS，充分混匀，24h内上流式细胞仪分析。
1.6外周血淋巴细胞活化标志的表达：采用三色荧光染色，在FALCON试管中加入20 µl FITC标记的抗CDl9单抗、PE标记的抗CD25单抗或抗HLA-DR单抗及叶绿素蛋白(Percp)标记的抗CD3单抗和三色同型对照免疫球蛋白(均为美国BD公司产品)，分别和100 µl抗凝血充分混匀，室温暗处反应15min，其余操作同方法3。
1.7统计学处理：所测数据以±s表示，统计分析采用SPSSl0.0软件，各组均数比较采用t检验。
2结果
2.1外周血淋巴细胞CD25和HLA-DR的表达：RA患者外周血中，T淋巴细胞CD25表达阳性率和B淋巴细胞CD25表达阳性率与正常对照组比均明显增多(p<0.01)，T淋巴细胞和B淋巴细胞的HLA-DR表达阳性率与正常对照组比差异均无统计学意义(p>0.05)。见表1。
表1RA患者外周血淋巴细胞CD25和HLA-DR的表达(±S，%)
T淋巴细胞B淋巴细胞
组别例数CD3+CD3+CD19+CD19+
CD25+HLA-DR+CD25+HLA-DR+
RA组308.2±2.5*20.2±12.52.6±1.1*15.8±7.3
对照组204.7±1.415.7±6.50.9±0.613.4±2.4
注：*与对照组比较P<0.01
2.2关节滑膜液淋巴细胞CD25和HLA-DR的表达：RA患者关节滑膜液中，T淋巴细胞HLA-DR表达阳性率明显增多(P<0.01)，而CD25表达阳性率与正常对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；但B淋巴细胞HLA-DR和CD25表达阳性率明显增多(P<0.01)表2。
表2RA患者关节滑膜液淋巴细胞CD25和HLA-DR的表达(±s，%)
T淋巴细胞B淋巴细胞
组别例数CD3+CD3+CD19+CD19+
CD25+HLA-DR+CD25+HLA-DR+
RA组200.3±0.26.5±1.2*0.5±0.2*13.9±1.9*
对照组100.1±0.16.5±1.2*0.1±0.010.0±1.3
注：*与对照组比较P<0.01
2.3外周血淋巴细胞协同刺激分子的表达：RA患者外周血中，B淋巴细胞CD86表达阳性率(1.9%±10.9%)与正常对照组(6.1%±2.3%)相比明显下降(P<0.01)，同时B淋巴细胞CD40表达阳性率(17.3%±7.7%)比正常对照组(12.4%±3.1%)明显增多(P<0.05)；而B淋巴细胞CD80表达阳性率(2 ......
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