循环DNA p16基因启动子区甲基化检测在非小细胞肺癌早期诊断中的意义(1)
【摘要】目的 评价检测循环DNA p16基因启动子区异常甲基化对非小细胞肺癌(NSCLC)早期诊断的价值。方法 应用甲基化特异性PCR方法检测NSCLC患者及NSCLC高危人群循环DNA p16基因启动子区甲基化频率,评价其诊断价值。结果 NSCLC患者循环DNA p16基因甲基化阳性率28.6%(6/21),高于非吸烟健康组0%(0/15,P=0.030),而NSCLC患者与重度吸烟组(10%,2/20),以及重度吸烟组与非吸烟健康组间差异均不具有统计学意义(P=0.238,P=0.496)。结论 检测循环DNA p16基因启动子区异常甲基化,有助于对NSCLC高危人群的筛查及对NSCLC的早期诊断。
【关键词】非小细胞肺癌循环DNAp16基因DNA甲基化
【中图分类号】R183【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2010)03-00-03
The significance of promoter hypermethylation of p16 gene in circulating DNA on early diagnosis of non-small cell lung cancer.
【Abstract】 Objective To evaluate the diagnostic value of detecting promoter hypermethylation of p16 gene in circulating DNA from non-small cell lung cancer (NSCLC) patients.Methods Methylation-specific PCR (MSP) was performed for the detection of promoter hypermethylation of p16 gene in circulating DNA from NSCLC patients and from high-risk groups of NSCLC. Its clinical diagnostic value of NSCLC was evaluated.Results The detectable rate of promoter hypermethylation of p16 gene in circulating DNA from NSCLC patients was 28.6% (6/21), higher than that of the non-smoking healthy group (0%, 0/15,P=0.030), while there was no significant difference between the detectable rate from NSCLC patients and that from the heavy smoking group (10%, 2/20, P=0.238), as well as that from the heavy smoking group and that from the non-smoking healthy group (P=0.496).Conclusion Detecting promoter hypermethylation of p16 gene in circulating DNA may be helpful screening for NSCLC in high-risk population, and for the early diagnosis of NSCLC.
【key words】NSCLC, circulating DNA, p16 gene, DNA hypermethylation
自从1998年Belinsky[1]应用MSP(甲基化特异性PCR)方法检测p16基因启动子区过度甲基化与NSCLC的相关性后,大量关于MSP方法检测p16基因甲基化与肺癌的研究报道得的结论:抑癌基因p16以启动子区CpG岛甲基化修饰的方式失活,这一事件在NSCLC发生的前期即已发生。
以往对于肺癌的研究多采用肺癌组织作为实验标本,这显然不能作为肺癌早期诊断的手段。因此,在影像学尚未发现或确定肺内实体肿瘤前即取得含有肿瘤DNA的标本,便成了MSP方法用于肺癌早期诊断的一个关键问题。
循环DNA概念的提出为这个问题提供了可能的解决途径。循环DNA又称血浆游离DNA。循环DNA理论认为,正常健康人体内细胞代谢调亡/坏死产生的DNA片段释放入血液,形成了循环DNA的主要成份。而在肿瘤病人,肿瘤细胞代谢旺盛,肿瘤坏死,将使血循环中含有较多的肿瘤DNA片段,凋亡/坏死肿瘤细胞DNA片段是肿瘤病人循环DNA的主要成份。
因此,采集受检者的血液,提取其中游离DNA,检测其p16基因启动子区甲基化便成了肺癌早期诊断的一种尝试。
1 材料与方法
1.1 研究对象的选择与标本选取
自我院2008年6月-2009年7月住院病人中选取NSCLC患者21例,年龄48-79岁,平均61.3岁,男16例,女5例。在特殊治疗(手术、化疗)前留取血样3ml,诊断均经纤支镜活检或手术病理证实。同时从同期体检志愿者中随机选取20例长期吸烟健康者(通常吸烟指数>400年支即认为是肺癌高危人群,本实验取吸烟指数≥600年支,并未戒过烟),年龄45-72岁,平均60.7岁,男18例,女2例;以及非吸烟健康者(从未主动吸过一支烟)15例,年龄32-75岁,平均年龄55.9岁,男9例,女6例。抽取血样5ml。将所留取的血样立刻3000转/分 离心10分钟。吸取上层血浆,肺癌患者各留取1ml血浆,吸烟者及非吸烟者各留取血浆2ml,液氮冻存。
1.2 DNA提取
将上述血浆应用磁珠吸附法血浆DNA提取试剂盒(上海微纳奥润公司)提取循环游离DNA。Sss1 CpG甲基转移酶(美国,NEB公司)甲基化修饰后的健康人全血基因组DNA做DNA甲基化阳性对照;胎盘血DNA做甲基化阴性对照及非甲基化阳性对照,双蒸水做非甲基化阴性对照。操作步骤严格依照相应说明书进行。
1.3 亚硫酸盐修饰
应用一步法修饰试剂盒(美国,Epigentek公司)同时对肿瘤组、吸烟组、健康组、阳性对照以及阴性对照组样品DNA行亚硫酸盐修饰,操作步骤依照说明书。
1.4 MSP检测
参照文献[2]设计p16基因引物:甲基化引物(p16-M),有义链5′ -TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3′,反义链5′-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3′,产物150bp;非甲基化引物(p16-U),有义链5′-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3′,反义链5′-CAACCCCAAACCACAACCATAA--3′,产物151bp。引物由上海生工合成。反应体系:预混LA Taq酶缓冲液(大连宝生物)10ul,甲基化(或非甲基化)正反引物各0.8ul,模板DNA5ul,加水至20ul。反应条件:先99℃预变性4分钟,之后加入LA Taq酶。98℃变性10秒钟,64℃(非甲基化60℃)退火30秒钟,72℃延伸30秒钟;共45个循环,最后72℃延伸4分钟。, 百拇医药
【关键词】非小细胞肺癌循环DNAp16基因DNA甲基化
【中图分类号】R183【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2010)03-00-03
The significance of promoter hypermethylation of p16 gene in circulating DNA on early diagnosis of non-small cell lung cancer.
【Abstract】 Objective To evaluate the diagnostic value of detecting promoter hypermethylation of p16 gene in circulating DNA from non-small cell lung cancer (NSCLC) patients.Methods Methylation-specific PCR (MSP) was performed for the detection of promoter hypermethylation of p16 gene in circulating DNA from NSCLC patients and from high-risk groups of NSCLC. Its clinical diagnostic value of NSCLC was evaluated.Results The detectable rate of promoter hypermethylation of p16 gene in circulating DNA from NSCLC patients was 28.6% (6/21), higher than that of the non-smoking healthy group (0%, 0/15,P=0.030), while there was no significant difference between the detectable rate from NSCLC patients and that from the heavy smoking group (10%, 2/20, P=0.238), as well as that from the heavy smoking group and that from the non-smoking healthy group (P=0.496).Conclusion Detecting promoter hypermethylation of p16 gene in circulating DNA may be helpful screening for NSCLC in high-risk population, and for the early diagnosis of NSCLC.
【key words】NSCLC, circulating DNA, p16 gene, DNA hypermethylation
自从1998年Belinsky[1]应用MSP(甲基化特异性PCR)方法检测p16基因启动子区过度甲基化与NSCLC的相关性后,大量关于MSP方法检测p16基因甲基化与肺癌的研究报道得的结论:抑癌基因p16以启动子区CpG岛甲基化修饰的方式失活,这一事件在NSCLC发生的前期即已发生。
以往对于肺癌的研究多采用肺癌组织作为实验标本,这显然不能作为肺癌早期诊断的手段。因此,在影像学尚未发现或确定肺内实体肿瘤前即取得含有肿瘤DNA的标本,便成了MSP方法用于肺癌早期诊断的一个关键问题。
循环DNA概念的提出为这个问题提供了可能的解决途径。循环DNA又称血浆游离DNA。循环DNA理论认为,正常健康人体内细胞代谢调亡/坏死产生的DNA片段释放入血液,形成了循环DNA的主要成份。而在肿瘤病人,肿瘤细胞代谢旺盛,肿瘤坏死,将使血循环中含有较多的肿瘤DNA片段,凋亡/坏死肿瘤细胞DNA片段是肿瘤病人循环DNA的主要成份。
因此,采集受检者的血液,提取其中游离DNA,检测其p16基因启动子区甲基化便成了肺癌早期诊断的一种尝试。
1 材料与方法
1.1 研究对象的选择与标本选取
自我院2008年6月-2009年7月住院病人中选取NSCLC患者21例,年龄48-79岁,平均61.3岁,男16例,女5例。在特殊治疗(手术、化疗)前留取血样3ml,诊断均经纤支镜活检或手术病理证实。同时从同期体检志愿者中随机选取20例长期吸烟健康者(通常吸烟指数>400年支即认为是肺癌高危人群,本实验取吸烟指数≥600年支,并未戒过烟),年龄45-72岁,平均60.7岁,男18例,女2例;以及非吸烟健康者(从未主动吸过一支烟)15例,年龄32-75岁,平均年龄55.9岁,男9例,女6例。抽取血样5ml。将所留取的血样立刻3000转/分 离心10分钟。吸取上层血浆,肺癌患者各留取1ml血浆,吸烟者及非吸烟者各留取血浆2ml,液氮冻存。
1.2 DNA提取
将上述血浆应用磁珠吸附法血浆DNA提取试剂盒(上海微纳奥润公司)提取循环游离DNA。Sss1 CpG甲基转移酶(美国,NEB公司)甲基化修饰后的健康人全血基因组DNA做DNA甲基化阳性对照;胎盘血DNA做甲基化阴性对照及非甲基化阳性对照,双蒸水做非甲基化阴性对照。操作步骤严格依照相应说明书进行。
1.3 亚硫酸盐修饰
应用一步法修饰试剂盒(美国,Epigentek公司)同时对肿瘤组、吸烟组、健康组、阳性对照以及阴性对照组样品DNA行亚硫酸盐修饰,操作步骤依照说明书。
1.4 MSP检测
参照文献[2]设计p16基因引物:甲基化引物(p16-M),有义链5′ -TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3′,反义链5′-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3′,产物150bp;非甲基化引物(p16-U),有义链5′-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3′,反义链5′-CAACCCCAAACCACAACCATAA--3′,产物151bp。引物由上海生工合成。反应体系:预混LA Taq酶缓冲液(大连宝生物)10ul,甲基化(或非甲基化)正反引物各0.8ul,模板DNA5ul,加水至20ul。反应条件:先99℃预变性4分钟,之后加入LA Taq酶。98℃变性10秒钟,64℃(非甲基化60℃)退火30秒钟,72℃延伸30秒钟;共45个循环,最后72℃延伸4分钟。, 百拇医药