流式细胞分析中荧光素选择问题探析
【摘要】选择多色流式细胞中荧光素最佳的组合是一个复杂的过程。本文总结了常用流式细胞荧光素和多色流式细胞中荧光素选择的原则。帮助大家选择多色流式细胞中荧光素，避免重复试验和错误。
【关键词】流式细胞；荧光素
近十年来流式细胞仪已经成为临床医生、免疫学家和细胞生物学家必不可少的工具，这项技术在不断进步。流式细胞仪的多参数细胞分析这一独特的功能让大多数细胞分析成为了可能。Coon首先提出了荧光抗体标记细胞内的目的蛋白技术，在20世纪80年代，细胞亚群仅仅通过检测单一的细胞表面标志物来确定，使用的单抗和荧光素很受限制。基因表达技术的诞生和新的单抗以及荧光素的获得使更复杂的多参数分析成为可能。
荧光素受到一定波长的激光激发后，释放出能量并发射出一定波长的荧光.因此，我们在选择荧光素时应注意各种荧光素的激发波长，以选择正确的激光器.例如FITC和PE、PI等的激发波长为488nm，APC等激发波长为630nm。FITC、PE、PE-Cy5为目前流式细胞仪的常用荧光素，基本能满足日常临床和科研的需要。随着多色流式细胞仪的出现，新荧光素和标记抗体也得到了长足发展。然而为实验中所需抗体选择最佳的荧光素组合是一个复杂的过程。如何选择多色流式细胞仪检测试剂组合，避免重复试验和错误，增加你实验成功的机会。试剂的选择首选是根据您仪器配置开始的。仪器中所装配的激光器和探测器的型号和数量决定了你的仪器的光学系统能否激发某个荧光素，并能否正确地检测某个荧光素组合。本文总结了一些常用流式细胞荧光素和多色流式细胞中荧光素选择的原则。
1常用荧光素的种类及特性[1]
1.1FITC(Fluorescein)又称异硫氰酸荧光素，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；FITC的最大发射波长为525nm，在流式细胞仪的FL1通道检测。
1.2PE(R-Phycoerythrin)又称藻红蛋白，有R-PE和RD1的别称，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PE的最大发射波长为575nm，在流式细胞仪的FL2通道检测。
1.3PE-TR(PE-TexasRed)/ECDPE-TR又名ECD，是由PE和TexasRed(TR)组合而成的Tandem荧光素；其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PE-TR的最大发射波长为615nm，在流式细胞仪的FL3通道检测；PE-TR标记的抗体可用于毫瓦级激光器的小流式细胞仪，也适用于配备有全功率激光器的大流式分选仪。
1.4PI(PropidiumIodide)又称碘化丙啶，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PI的最大发射波长为617nm。在流式细胞仪的FL3通道检测。
1.5PE-Cy5(TRI-COLOR，TC)又称TRI-COLOR或TC，是由PE和Cy5组合而成的Tandem荧光素；其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PE-Cy5的最大发射波长为670nm，在流式细胞仪上用FL4通道检测；PE-Cy5标记的抗体可用于毫瓦级激光器的小流式细胞仪，也适用于配备有全功率激光器的大流式分选仪。
1.6PerCP(Peridinin-Chlorophyll-ProteinComplex)多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PerCP的最大发射波长为677nm。在流式细胞仪的FL4通道检测。
1.7APC(Allophycocyanin)又称别藻蓝蛋白，其标记的抗体适用于配备氦氖激光器发射波长为633nm的多色流式细胞仪；APC最大发射波长为660nm，在流式细胞仪中只有配有双激光器的FL4才能检测。
1.8APC-Cy7是由APC和Cy7组合而成的Tandem荧光素；其标记的抗体适用于配备氦氖激光器发射波长为633nm的多色流式细胞仪，APC-Cy7主要用于四色以上的流式细胞术。
2荧光素选用方法及原则
2.1尽量选择荧光度强的荧光素FITC、PE、PE-cy5和APC为目前流式细胞仪的常用荧光素，基本能满足日常临床和科研的需要。荧光素的荧光强度是有区别的，FITC为荧光强度比较弱的素，而APC、PE和PE-cy5为荧光比较强的素。尽量选择荧光强的荧光素。细胞表面或内部的各种抗原表达量也不同，如CD4和CD8在细胞表面的表达分子数很多，而CD25等分子在细胞上的表达量则不多。在用流式细胞术分析这些分子时应根据表达量来选择荧光素，对于表达较多的分子，可用FITC等弱荧光素，而对于表达较少的分子，则须要用荧光较强的素，包括PE、PE-Cy5和PE-Cy5.5等，针对您特定的仪器配置，选择最亮的荧光素。
2.2多荧光素组合，尽量选择同一激光激发当多荧光素组合时候，尽量选择同一激光激发，如果不同激发器激发，在实际检测中会因为两激光调节不同，影响荧光素的灵敏度。
2.3搭配荧光素之间发射光谱重叠尽量小每个荧光通道选一种荧光，荧光素可随意搭配，但是应该考虑荧光素之间发射光谱重叠问题，选择试剂组合时要将光谱叠加可能性减到最低。这可以能与选择最亮的荧光素的规则是冲突的。如在进行四色分析，经常会将PE-Cy5标记的抗体与APC标记的抗体搭配使用，此搭配需较大幅度地调节两者的颜色补偿。可选用PE-Cy5.5来替代PE-Cy5，颜色补偿只需1%左右。因为Cy5的激发波长与APC的激发波长相近，所以PE-Cy5荧光素中的Cy5，也会被激发APC的第二个激光器(氦氖激光器)所激发，导致PE-Cy5与APC的颜色补偿很难调。相反，PE-Cy5.5中的Cy5.5激发波长为675nm，不能被激发APC的第二个激光器所激发，也就不存在Cy5.5对APC的干扰，颜色补偿也就很小。因此，可能需要牺牲个别的荧光的亮度来避免荧光渗漏以及敏感度丧失。
综上所述，本文总结了一些多色流式细胞术荧光素选择的规则，这些规则需要达到一个平衡状态，才能得到最佳的实验结果，针对特定的流式细胞仪器配置，选择最亮的荧光素，同时选则荧光素要尽量降低光谱叠加的可能，保留最亮的荧光素给弱表达的抗体。
参考文献
[1]梁智辉，朱慧芬，陈九武编著.第1版.流式细胞术基本原理与实用技术.武汉：华中科技大学出版社，2008：27-36., 百拇医药(谷焕鹏胡升芳)
【关键词】流式细胞；荧光素
近十年来流式细胞仪已经成为临床医生、免疫学家和细胞生物学家必不可少的工具，这项技术在不断进步。流式细胞仪的多参数细胞分析这一独特的功能让大多数细胞分析成为了可能。Coon首先提出了荧光抗体标记细胞内的目的蛋白技术，在20世纪80年代，细胞亚群仅仅通过检测单一的细胞表面标志物来确定，使用的单抗和荧光素很受限制。基因表达技术的诞生和新的单抗以及荧光素的获得使更复杂的多参数分析成为可能。
荧光素受到一定波长的激光激发后，释放出能量并发射出一定波长的荧光.因此，我们在选择荧光素时应注意各种荧光素的激发波长，以选择正确的激光器.例如FITC和PE、PI等的激发波长为488nm，APC等激发波长为630nm。FITC、PE、PE-Cy5为目前流式细胞仪的常用荧光素，基本能满足日常临床和科研的需要。随着多色流式细胞仪的出现，新荧光素和标记抗体也得到了长足发展。然而为实验中所需抗体选择最佳的荧光素组合是一个复杂的过程。如何选择多色流式细胞仪检测试剂组合，避免重复试验和错误，增加你实验成功的机会。试剂的选择首选是根据您仪器配置开始的。仪器中所装配的激光器和探测器的型号和数量决定了你的仪器的光学系统能否激发某个荧光素，并能否正确地检测某个荧光素组合。本文总结了一些常用流式细胞荧光素和多色流式细胞中荧光素选择的原则。
1常用荧光素的种类及特性[1]
1.1FITC(Fluorescein)又称异硫氰酸荧光素，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；FITC的最大发射波长为525nm，在流式细胞仪的FL1通道检测。
1.2PE(R-Phycoerythrin)又称藻红蛋白，有R-PE和RD1的别称，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PE的最大发射波长为575nm，在流式细胞仪的FL2通道检测。
1.3PE-TR(PE-TexasRed)/ECDPE-TR又名ECD，是由PE和TexasRed(TR)组合而成的Tandem荧光素；其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PE-TR的最大发射波长为615nm，在流式细胞仪的FL3通道检测；PE-TR标记的抗体可用于毫瓦级激光器的小流式细胞仪，也适用于配备有全功率激光器的大流式分选仪。
1.4PI(PropidiumIodide)又称碘化丙啶，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PI的最大发射波长为617nm。在流式细胞仪的FL3通道检测。
1.5PE-Cy5(TRI-COLOR，TC)又称TRI-COLOR或TC，是由PE和Cy5组合而成的Tandem荧光素；其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PE-Cy5的最大发射波长为670nm，在流式细胞仪上用FL4通道检测；PE-Cy5标记的抗体可用于毫瓦级激光器的小流式细胞仪，也适用于配备有全功率激光器的大流式分选仪。
1.6PerCP(Peridinin-Chlorophyll-ProteinComplex)多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PerCP的最大发射波长为677nm。在流式细胞仪的FL4通道检测。
1.7APC(Allophycocyanin)又称别藻蓝蛋白，其标记的抗体适用于配备氦氖激光器发射波长为633nm的多色流式细胞仪；APC最大发射波长为660nm，在流式细胞仪中只有配有双激光器的FL4才能检测。
1.8APC-Cy7是由APC和Cy7组合而成的Tandem荧光素；其标记的抗体适用于配备氦氖激光器发射波长为633nm的多色流式细胞仪，APC-Cy7主要用于四色以上的流式细胞术。
2荧光素选用方法及原则
2.1尽量选择荧光度强的荧光素FITC、PE、PE-cy5和APC为目前流式细胞仪的常用荧光素，基本能满足日常临床和科研的需要。荧光素的荧光强度是有区别的，FITC为荧光强度比较弱的素，而APC、PE和PE-cy5为荧光比较强的素。尽量选择荧光强的荧光素。细胞表面或内部的各种抗原表达量也不同，如CD4和CD8在细胞表面的表达分子数很多，而CD25等分子在细胞上的表达量则不多。在用流式细胞术分析这些分子时应根据表达量来选择荧光素，对于表达较多的分子，可用FITC等弱荧光素，而对于表达较少的分子，则须要用荧光较强的素，包括PE、PE-Cy5和PE-Cy5.5等，针对您特定的仪器配置，选择最亮的荧光素。
2.2多荧光素组合，尽量选择同一激光激发当多荧光素组合时候，尽量选择同一激光激发，如果不同激发器激发，在实际检测中会因为两激光调节不同，影响荧光素的灵敏度。
2.3搭配荧光素之间发射光谱重叠尽量小每个荧光通道选一种荧光，荧光素可随意搭配，但是应该考虑荧光素之间发射光谱重叠问题，选择试剂组合时要将光谱叠加可能性减到最低。这可以能与选择最亮的荧光素的规则是冲突的。如在进行四色分析，经常会将PE-Cy5标记的抗体与APC标记的抗体搭配使用，此搭配需较大幅度地调节两者的颜色补偿。可选用PE-Cy5.5来替代PE-Cy5，颜色补偿只需1%左右。因为Cy5的激发波长与APC的激发波长相近，所以PE-Cy5荧光素中的Cy5，也会被激发APC的第二个激光器(氦氖激光器)所激发，导致PE-Cy5与APC的颜色补偿很难调。相反，PE-Cy5.5中的Cy5.5激发波长为675nm，不能被激发APC的第二个激光器所激发，也就不存在Cy5.5对APC的干扰，颜色补偿也就很小。因此，可能需要牺牲个别的荧光的亮度来避免荧光渗漏以及敏感度丧失。
综上所述，本文总结了一些多色流式细胞术荧光素选择的规则，这些规则需要达到一个平衡状态，才能得到最佳的实验结果，针对特定的流式细胞仪器配置，选择最亮的荧光素，同时选则荧光素要尽量降低光谱叠加的可能，保留最亮的荧光素给弱表达的抗体。
参考文献
[1]梁智辉，朱慧芬，陈九武编著.第1版.流式细胞术基本原理与实用技术.武汉：华中科技大学出版社，2008：27-36., 百拇医药(谷焕鹏胡升芳)