乙型肝炎病毒宫内感染及其相关因素的研究
【摘要】 目的 探讨孕妇血清乙型肝炎病毒(HBV)标志物与胎儿宫内感染发生的关系。方法 将62例HBsAg阳性孕妇及其胎儿为观察组，60例HBsAg阴性孕妇及其胎儿为对照组。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测两组孕妇血清HbsAg、HBeAg、及经利凡诺尔引产的胎儿心脏血清HBsAg，用Southern印记杂交法检测两组孕妇血清HBV—DNA和胎儿肝细胞HBV—DNA。结果 观察组62例HbsAg阳性孕妇血清中，HBeAg阳性26例，HBV—DNA阳性44例；其胎儿HBsAg阳性9例(14.52%)，HBV—DNA阳性10例(22.73%)。对照组60例HBsAg阴性孕妇血清中，HBeAg阳性4例，HBV—DNA检测结果均为阴性。其胎儿HBsAgl例(1.67%)，HBV—DNA检测结果均阴性。胎肝HBV—DNA的整合与孕妇HBV—DNA存在相关(x2=4.88，P<0.05)。结论 HBV可以进入宫腔内感染胎儿，同时证明孕妇HBeAg和HBV—DNA阳性是胎儿宫内感染HBV的高危因素。
【关键词】 乙型肝炎病毒；宫内感染；高危因素
1 资料与方法
1.1 研究对象 2009年3月—2011年6月间在河南郑州、鹤壁两个地区中的三个市级医院收集62例妊娠中、晚期HBsAg阳性的孕妇及其经利凡诺尔引产的62例死胎作为研究对象，同时设60例对照，孕妇除HBsAg阴性外，其余条件与观察组相似。
1.2 标本采集 胎儿娩出后，立即清洗其胸腹部皮肤，经胸壁心脏穿刺采集心血5ml，并抽取孕妇静脉血5—10ml，分离血清，置—20℃保存。
同时，采集胎儿肝脏标本10—20g置液氮保存。
1.3 方法
1.3.1 血清学检测 孕妇血清HBsAg、HBeAg及胎儿血清HBsAg检测均采用酶联免疫吸附法(ELISA)。试剂盒购自上海科华实业有限公司，严格按照说明书操作。以P/N值≥2.1判为阳性。
1.3.2 HBV DNA Southern印迹杂交 ①DNA制备：孕妇血清DNA及胎肝DNA的提取参照王申五等方法；②HBV DNA全基因探针的制备及标记：从含HBV全基因组的重组质粒中分离纯化制备探针，并用地高辛(Dig—11—dulP)标记(华美生物制品有限公司试剂盒)；③DNA的酶解与Southern印迹杂交：10μgDNA样品加100μg EcoRI限制性内切酶37℃温育4—6h，将酶解产物在1%琼脂糖凝胶中电泳18—20h，电压1.5v/cm。分子量标志用λDNA/hindⅢ。用重组质粒PcplO酶切、分离纯化的HBV DNA(3.2kb)做阳性对照。
电泳完毕，凝胶经酸化、变性、中和处理，按王申五等方法将疑胶中的DNA真空转移到尼龙膜上。68℃预杂交lh，杂交(Dig—11—dUTP标记的探针)6h，室温洗膜两次，各15min，68℃洗膜两次，各15min。将膜于地高辛—抗体—碱性磷酸酶显色体系中进行显色反应，当出现带时，终止反应，观察结果，照相。
1.4 统计学方法 采用卡方检验法。
2 结 果
2.1 孕妇血清与胎心血清HBV标志物检测结果 观察组62例HbsAg出阳性母血中，HbeAg阳性26例，HBV DNA HbsAg阳性44例；在62例胎儿中，HbsAg阳性9例，HBV DNA阳性10例。
对照组60例HbsAg阴性母血中，HbeAg阳性4例，HBV DNA检测结果均阴性：在60例胎儿中，HbsAg阳性1例，HBV 的DNA检测结果均阴性。
2.2 HbsAg阳性胎儿与母亲HbsAg和/或HBeAg阳性的关系。
2.3 胎肝HBV DNA整合状态及其与母亲血清HBV标志物的关系 62例HBsAg阳性母亲的胎儿中，10例胎肝细胞DNA用EcoR 1酶解，再与地高辛标记的HBV DNA探针杂交后，出现大于3.2Kb的HBV DNA特异杂交带。由于HBV DNA在细胞基因组中没有固定的位点，故表现出HBV DNA整合基因序列不同。
62例HBsAg阳性母亲，有44例检测出不同序列的大于3.2Kb的HBV DNA特异杂交带。观察组其他样本及对照组全部样本均未检测出HBV DNA整合带。
观察组HBV DNA阳性母亲的胎儿较HBV DNA阴性母亲的胎儿更易发生宫内感染。
胎儿肝细胞HBV DNA整合状态与母血清标志物的关系。在10例胎肝HBV DNA阳性中，其HBsAg均为阳性。
3 讨 论
关于HBV能否经胎盘感染胎儿，曾长期存在着分歧。但有研究证明妊娠期间患有急性乙肝的母亲易发生母婴传播。通过检测HBsAg阳性孕妇流产或引产死胎的胎肝或胎心血测到HBV感染标记物，国内外资料报道乙型肝炎病毒发生宫内感染率达13%—44%。在我们的研究中，HBsAg阳性孕妇的胎儿HBV宫内感染率达14.5%，与对照组HBsAg阴性孕妇相比，有显著差异(P<0.05)，证实了宫内感染的存在。
在决定母婴是否发生的母方因素中，母血HBeAg是否阳性是一个重要因素。HBeAg是HBV活跃的一个指标1。本研究结果也表明胎儿感染HBV与母亲HBeAg有一定关系(P<0.05)。
HBeAg与HBV DNA是乙肝病毒的复制指标，任何一项阳性即可表示HBV在体内复制，传染性强2。因此，对HBsAg阳性孕妇检测HBeAg和HBV DNA，可估计其胎儿发生宫内感染的危险性，针对高危人群采取适当措施，以降低HBV宫内感染发生率。
我国调查资料表明，HBsAg阳性母亲所生婴儿约40%在出生后3—6个月成为HBsAg携带者，其中80%可变成慢性携带者。这些人群不但是社会上为数众多的HBV传染源，而且可发展为慢性活动性肝炎，肝硬化甚至成为原发性肝癌。因此，认识和阻断HBV宫内感染，对控制HBV的流行，降低原发性肝癌发病率等具有重要意义。朱启榕等对携带HBsAg的孕妇于产前多次肌内注射乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)，可减少宫内感染的发生，其机理尚需进一步研究。
参考文献
[1] 董兆文，王文启，主编.母婴传播疾病诊断技术与防治.北京：中国人口出版社，1996.
[2] Beasley RP.Prevention 0f perinatally transmitted hepatitis Bvirus infection with hepatitis B immune globulin and hepatitis B vaccine.Lancet，1983，2：1099—1102., http://www.100md.com(杨柳 周世媛)
【关键词】 乙型肝炎病毒；宫内感染；高危因素
1 资料与方法
1.1 研究对象 2009年3月—2011年6月间在河南郑州、鹤壁两个地区中的三个市级医院收集62例妊娠中、晚期HBsAg阳性的孕妇及其经利凡诺尔引产的62例死胎作为研究对象，同时设60例对照，孕妇除HBsAg阴性外，其余条件与观察组相似。
1.2 标本采集 胎儿娩出后，立即清洗其胸腹部皮肤，经胸壁心脏穿刺采集心血5ml，并抽取孕妇静脉血5—10ml，分离血清，置—20℃保存。
同时，采集胎儿肝脏标本10—20g置液氮保存。
1.3 方法
1.3.1 血清学检测 孕妇血清HBsAg、HBeAg及胎儿血清HBsAg检测均采用酶联免疫吸附法(ELISA)。试剂盒购自上海科华实业有限公司，严格按照说明书操作。以P/N值≥2.1判为阳性。
1.3.2 HBV DNA Southern印迹杂交 ①DNA制备：孕妇血清DNA及胎肝DNA的提取参照王申五等方法；②HBV DNA全基因探针的制备及标记：从含HBV全基因组的重组质粒中分离纯化制备探针，并用地高辛(Dig—11—dulP)标记(华美生物制品有限公司试剂盒)；③DNA的酶解与Southern印迹杂交：10μgDNA样品加100μg EcoRI限制性内切酶37℃温育4—6h，将酶解产物在1%琼脂糖凝胶中电泳18—20h，电压1.5v/cm。分子量标志用λDNA/hindⅢ。用重组质粒PcplO酶切、分离纯化的HBV DNA(3.2kb)做阳性对照。
电泳完毕，凝胶经酸化、变性、中和处理，按王申五等方法将疑胶中的DNA真空转移到尼龙膜上。68℃预杂交lh，杂交(Dig—11—dUTP标记的探针)6h，室温洗膜两次，各15min，68℃洗膜两次，各15min。将膜于地高辛—抗体—碱性磷酸酶显色体系中进行显色反应，当出现带时，终止反应，观察结果，照相。
1.4 统计学方法 采用卡方检验法。
2 结 果
2.1 孕妇血清与胎心血清HBV标志物检测结果 观察组62例HbsAg出阳性母血中，HbeAg阳性26例，HBV DNA HbsAg阳性44例；在62例胎儿中，HbsAg阳性9例，HBV DNA阳性10例。
对照组60例HbsAg阴性母血中，HbeAg阳性4例，HBV DNA检测结果均阴性：在60例胎儿中，HbsAg阳性1例，HBV 的DNA检测结果均阴性。
2.2 HbsAg阳性胎儿与母亲HbsAg和/或HBeAg阳性的关系。
2.3 胎肝HBV DNA整合状态及其与母亲血清HBV标志物的关系 62例HBsAg阳性母亲的胎儿中，10例胎肝细胞DNA用EcoR 1酶解，再与地高辛标记的HBV DNA探针杂交后，出现大于3.2Kb的HBV DNA特异杂交带。由于HBV DNA在细胞基因组中没有固定的位点，故表现出HBV DNA整合基因序列不同。
62例HBsAg阳性母亲，有44例检测出不同序列的大于3.2Kb的HBV DNA特异杂交带。观察组其他样本及对照组全部样本均未检测出HBV DNA整合带。
观察组HBV DNA阳性母亲的胎儿较HBV DNA阴性母亲的胎儿更易发生宫内感染。
胎儿肝细胞HBV DNA整合状态与母血清标志物的关系。在10例胎肝HBV DNA阳性中，其HBsAg均为阳性。
3 讨 论
关于HBV能否经胎盘感染胎儿，曾长期存在着分歧。但有研究证明妊娠期间患有急性乙肝的母亲易发生母婴传播。通过检测HBsAg阳性孕妇流产或引产死胎的胎肝或胎心血测到HBV感染标记物，国内外资料报道乙型肝炎病毒发生宫内感染率达13%—44%。在我们的研究中，HBsAg阳性孕妇的胎儿HBV宫内感染率达14.5%，与对照组HBsAg阴性孕妇相比，有显著差异(P<0.05)，证实了宫内感染的存在。
在决定母婴是否发生的母方因素中，母血HBeAg是否阳性是一个重要因素。HBeAg是HBV活跃的一个指标1。本研究结果也表明胎儿感染HBV与母亲HBeAg有一定关系(P<0.05)。
HBeAg与HBV DNA是乙肝病毒的复制指标，任何一项阳性即可表示HBV在体内复制，传染性强2。因此，对HBsAg阳性孕妇检测HBeAg和HBV DNA，可估计其胎儿发生宫内感染的危险性，针对高危人群采取适当措施，以降低HBV宫内感染发生率。
我国调查资料表明，HBsAg阳性母亲所生婴儿约40%在出生后3—6个月成为HBsAg携带者，其中80%可变成慢性携带者。这些人群不但是社会上为数众多的HBV传染源，而且可发展为慢性活动性肝炎，肝硬化甚至成为原发性肝癌。因此，认识和阻断HBV宫内感染，对控制HBV的流行，降低原发性肝癌发病率等具有重要意义。朱启榕等对携带HBsAg的孕妇于产前多次肌内注射乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)，可减少宫内感染的发生，其机理尚需进一步研究。
参考文献
[1] 董兆文，王文启，主编.母婴传播疾病诊断技术与防治.北京：中国人口出版社，1996.
[2] Beasley RP.Prevention 0f perinatally transmitted hepatitis Bvirus infection with hepatitis B immune globulin and hepatitis B vaccine.Lancet，1983，2：1099—1102., http://www.100md.com(杨柳 周世媛)