七叶亭对巨噬细胞株TNF—α、IL—6和NF—κB影响的实验研究(2)
1.5 统计学分析
使用GraphPad Prism 5.0分析软件，数据以mean ± S.E.M.表示。各组间的比较采用单因素方差分析 (One-Way ANOVA)。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Esculetin对巨噬细胞活性的影响
本试验选用浓度分别为12.5μM、25μM、50μM的Esculetin作用于巨噬细胞，观察Esculetin对细胞活力的影响。与对照组相比，不同药物浓度的Esculetin对细胞活力无明显影响 (P>0.05)
2.2 Esculetin对巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6的影响
与对照组相比较，不同浓度的Esculetin组上清中TNF-α、IL-6浓度明显降低(P<0.05)，并呈剂量依赖性：Esculetin 25μM对巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6的抑制作用强于Esculetin 12.5μM (P<0.05)；Esculetin50μM对巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6的抑制作用强于Esculetin 25μM (P<0.05)
2.3 Esculetin对NF-κB蛋白表达的影响
与对照组相比较，不同浓度的Esculetin对NF-κB p65的活化水平有明显抑制(P<0.05)。Esculetin 25μM和Esculetin 50μM对NF-κB p65活化水平的抑制作用强于Esculetin 12.5μM (P<0.05)，但Esculetin50μM和Esculetin 25μM对NF-κB p65活化水平的抑制作用差别不大(P>0.05)。
3 讨论
AS是一个复杂的慢性炎症性病理过程[1]，它具备组织细胞变性、坏死，单核/淋巴细胞渗出，平滑肌细胞纤维性增殖等经典炎症反应的基本病理学特征[ 2-3]。同时也存在一般慢性炎症反应所没有的特殊现象，如脂质沉积、钙化和血栓形成等，且有免疫系统参与[4]。大量的炎症因子对AS的形成和发展发挥了至关重要的作用[5]。而血管壁的炎性反应最初是对血管损伤的保护机制，通过炎性细胞如单核细胞、巨噬细胞增生保持机体内环境的稳定，但如果炎症未能及时消除，则会对组织、血管造成破坏。抗炎干预是防治AS的新的研究方向和途径[6]。研究炎症反应在AS发生、发展和恶化中所起的作用，有助于理解不同的干预措施减少临床事件的机制，本实验将抑制巨噬细胞炎症因子表达作为抑制AS发生、发展的重要手段。
很多中药具有抗炎、 抗肿瘤和免疫调节等作用，采用具有抗炎作用的中药治疗AS可能成为很有希望的研究方向。Esculetin是双香豆素类的衍生物，具有很多生物学活性，具有很强的抗炎作用，临床上有用于对骨关节炎的治疗[7]；其传统功效清热燥湿、平喘止咳、收涩、明目，可用于治疗细菌性痢疾、肠炎和气管炎有很好的效果。Esculetin还是一种脂溶性药物，易穿透细胞膜，并在动脉壁内扩散[8-9]；Esculetin能干扰细胞增生周期，有效抑制炎症介导促细胞增殖作用[10]。
目前认为巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等炎性细胞的激活是AS始动环节，巨噬细胞参与从脂质沉积到斑块破裂的所有过程[11]。由于巨噬细胞的浸润，进一步引发局部和全身天然的和继发的免疫反应[12]，监测和调控外周血单核和动脉组织巨噬细胞是防治AS的首要和关键因素。RAW264.7细胞是来源于小鼠巨噬细胞的细胞系，来源广泛、贴壁易养、性质稳定，具有巨噬细胞的特性，在许多研究形成的通路、抗炎药物的作用机制以及炎症信号传导通路的实验中，很多都以RAW264.7巨噬细胞作为研究对象[13-15]。本实验以巨噬细胞株RAW264.7为作用细胞，选用浓度分别为12.5μM、25μM、50μM的Esculetin培养24h，并通过MTT来检测药物对细胞的影响，结果显示不同药物浓度对细胞活力没有影响。
巨噬细胞之所以能在AS中发挥作用，与其分泌的多种细胞因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α等)有关[5]。IL- 6、TNF-α通过细胞一系列的信号转导活化NF-κB，使炎症介质和细胞因子的基因转录增强，进一步促使中膜的平滑肌细胞向内膜下迁移、增殖并发生表型转化，还导致更多的炎症介质TNF-α和IL-6释放，促使更多的单核细胞聚集、浸润，而TNF-α和IL-6又可作为NF-κB的胞外刺激信号，进一步激活NF-κB，导致最初的炎症信号进一步放大，最终导致AS 病变的发生发展[16]。目前人们对于细胞因子间存在着“交叉联系”，其复杂网络中各环节的具体作用及详细机制还了解不足，故尚须进行大量的实验研究过程，来探讨可能从内在的分子机制。我们的实验以炎性因子TNF-α、IL-6的分泌为切入点，证实Esculetin能抑制炎性因子TNF-α、IL-6的分泌，并呈现明显的剂量依赖性，随着药物浓度的增加，抑制炎症因子分泌的作用也越来越强，通过抑制炎性因子分泌证明Esculetin的抗炎作用。观察不同浓度的Esculetin对NF-κB的蛋白活化的影响。Western blot结果证实，与对照组相比，不同浓度的Esculetin可抑制NF-κB p65的蛋白表达，从而我们猜想Esculetin是通过NF-κB信号通路抑制巨噬细胞发挥抗炎作用。
综上所述，Esculetin能够通过NF-κB有效抑制巨噬细胞炎性因子的分泌，从而有效抑制血管炎症反应，发挥抗AS的作用。目前国内外尚鲜有关于此方面的报道，但随着中药日趋受到重视和越来越广泛的心血管临床应用，挑选新的低毒、低廉、高效的心血管药物越发重要，我们认为Esculetin这种抗AS的中药将可能有效用于心血管疾病的治疗中，本研究初步提供Esculetin抗AS的理论和实验依据，为日后Esculetin在心血管临床的应用奠定基础，相信不久的将来，对Esculetin在心血管中应用会有更深层次的了解。(刘金 夏勇)