七叶亭对巨噬细胞株TNF—α、IL—6和NF—κB影响的实验研究(1)
【摘 要】目的：探索七叶亭(Esculetin)对巨噬细胞株RAW264.7细胞活性及分泌炎性因子TNF-α、IL-6和NF-κB表达的影响。方法：分别加入12.5、25、50μM的Esculetin与巨噬细胞RAW264.7共培养24h后，MTT观察不同浓度Esculetin对细胞活力的影响； ELISA检测上清液中TNF-α、IL-6含量；Western blot检测NF-κB的表达。结果：不同浓度的Esculetin对RAW264.7活力无明显影响；不同浓度的Esculetin可抑制巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6，浓度越高，抑制作用越强；Esculetin抑制NF-κB蛋白的活化作用随浓度变化而不同，25μM和50μM对NF-κB活化的抑制作用最强。结论： Esculetin对巨噬细胞株RAW264.7的活力无明显影响；Esculetin能抑制炎性因子TNF-α、IL-6的分泌，并呈剂量依赖关系；能抑制NF-κB蛋白的活化。其发挥抗炎作用有可能是依赖NF-κB信号通路而完成的。
【关键词】七叶亭；巨噬细胞；TNF-α；IL-6；NF-κB
, 百拇医药
【中图分类号】R 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2012)12-0013-03
动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)是缺血性心脑血管病的病理基础，心脑血管病发病率与死亡率近年也明显增加。AS具有慢性炎症反应特征的病理过程[1]，而且AS从粥样硬化斑块形成到斑块破裂，导致血栓形成的各个阶段，都有炎症细胞和炎症介质参与。本研究用七叶亭(Esculetin)作用于巨噬细胞 RAW264.7，观察巨噬细胞活性、分泌TNF-α、IL-6以及对NF-κB活化的影响，探讨七叶亭抑制炎症反应-抗动脉粥样硬化的可能机制。
1 材料与方法
1.1 细胞株 小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7购自中科院上海细胞生物学研究所
1.2 实验试剂 七叶亭( Alfa公司)，MTT ( Sigma公司 )，胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)，DMEM培养基(南京凯基生物工程有限公司)，小鼠TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，兔抗NF-κB p65，p-NF-κB p-p65抗体(Cell signaling公司)，β-actin蛋白多克隆一抗，山羊抗兔二抗，马抗小鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
, 百拇医药
1.3 主要仪器与设备
低温高速离心机(中国科大创新股份有限公司)，电热恒温水浴箱(北京医疗设备厂)，Olympus荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)，酶标仪Bio-Rad 550(美国伯乐公司)，微型高速离心机(珠江黑马医学仪器有限公司)，-80℃超低温冰箱、超净工作台(美国Forma公司)，CO2培养箱(香港力康Heal force公司)，微量加液器(芬兰Biohit公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞活性的 MTT检测
(1)接种细胞：用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化液将培养的第3代RAW264.7细胞从细胞培养瓶壁消化下来，再用含10%胎牛血清培养基配成单细胞悬液，调细胞密度2.5×104个/mL，每孔200μL，接种在96孔板中；(2)实验分组：空白对照组，Esculetin12.5μM，Esculetin25μM，Esculetin50μM(见表1)。每组设4个复孔；(3)细胞培养：37℃、5% CO2条件下培养，24h后换无血清DMEM培养液，继续孵育24 h后加入药物干预24h；(4)呈色：分别于药物作用结束前4h，每孔加5mg·mL- 1 MTT 20μL，4h后终止培养，吸弃孔内上清液，每孔加150μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min使结晶充分溶解；(5)比色：在酶标仪上490 nm波长处测定吸光度。
, http://www.100md.com
1.4.2 巨噬细胞 RAW264.7分泌TNF-α、IL-6的检测
用含10%胎牛血清培养基培养RAW264.7细胞，细胞长满瓶底80%时，弃去培养基，加PBS液漂洗 2次；加入含胰酶和EDTA的消化液1-2ml，37℃消化约2min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化；弃消化液加PBS液漂洗 2次，加入新培养液10 ml，反复吹打混悬细胞，细胞密度调整为1×55/ml；以每孔 1ml细胞悬液将细胞接种到6孔板，每孔再加培养基4ml；然后将6孔板放入 5%CO2孵箱37℃培养24h，待细胞长满瓶底80%时(见图1)，弃去上清液，分别加入终浓度为0(空白对照)，12.5μM，25μM，50μM的含药培养基DMEM， 继续培养24h。收集每孔培养基2ml，1000r/min离心20 min，取上清液，放入-20℃保存，留作检测TNF-α、IL-6。TNF-α、IL-6的检测分别按TNF-α、IL-6ELISA试剂盒说明书操作，每组设复孔10个。
1.4.3 巨噬细胞RAW264.细胞NF-κB活化水平的检测
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(1)选择生长良好的巨噬细胞，胰蛋白酶制备细胞悬液，分入6孔板(选用其中4孔)，调整细胞密度，待细胞贴壁生长至80-90%汇合时，吸弃原含10%胎牛血清的培养液，换用无血清的DMEM培养液继续培养24h，使巨噬细胞同步化，处于G0/G1期。各实验组加入相应药物干预，对照组不处理，放入培养箱中继续培养，在24h后结束培养。取出6孔板，倒掉培养基，预冷的4℃PBS液润洗培养板2次，吸净残液，用细胞刮刀将细胞刮下，离心收集，加入细胞膜裂解液，混匀后冰浴15min，13000g离心15min，上清液作为胞浆蛋白提取物进行蛋白质印迹分析；沉淀用细胞膜裂解液洗涤一次，混悬于细胞核裂解液，混匀后-20℃冷冻过夜，13000g离心15min，上清液作为核蛋白提取物进行蛋白质印迹分析，用于分析NF-κB p65入核；(2)用BCA蛋白测定试剂盒说明书分别测定胞浆蛋白和核蛋白浓度；(3)SDS-PAGE凝胶电泳分离，电转移蛋白至PVDF膜，用5 %的脱脂奶粉在室温下封闭1h，洗膜后加入一抗在摇床孵育2h，然后4℃过夜，第二天洗膜后加入二抗在室温孵育2h，漂洗去除未结合的二抗，在暗室中进行显色。, 百拇医药(刘金 夏勇)
【关键词】七叶亭；巨噬细胞；TNF-α；IL-6；NF-κB
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【中图分类号】R 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2012)12-0013-03
动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)是缺血性心脑血管病的病理基础，心脑血管病发病率与死亡率近年也明显增加。AS具有慢性炎症反应特征的病理过程[1]，而且AS从粥样硬化斑块形成到斑块破裂，导致血栓形成的各个阶段，都有炎症细胞和炎症介质参与。本研究用七叶亭(Esculetin)作用于巨噬细胞 RAW264.7，观察巨噬细胞活性、分泌TNF-α、IL-6以及对NF-κB活化的影响，探讨七叶亭抑制炎症反应-抗动脉粥样硬化的可能机制。
1 材料与方法
1.1 细胞株 小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7购自中科院上海细胞生物学研究所
1.2 实验试剂 七叶亭( Alfa公司)，MTT ( Sigma公司 )，胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)，DMEM培养基(南京凯基生物工程有限公司)，小鼠TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，兔抗NF-κB p65，p-NF-κB p-p65抗体(Cell signaling公司)，β-actin蛋白多克隆一抗，山羊抗兔二抗，马抗小鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
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1.3 主要仪器与设备
低温高速离心机(中国科大创新股份有限公司)，电热恒温水浴箱(北京医疗设备厂)，Olympus荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)，酶标仪Bio-Rad 550(美国伯乐公司)，微型高速离心机(珠江黑马医学仪器有限公司)，-80℃超低温冰箱、超净工作台(美国Forma公司)，CO2培养箱(香港力康Heal force公司)，微量加液器(芬兰Biohit公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞活性的 MTT检测
(1)接种细胞：用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化液将培养的第3代RAW264.7细胞从细胞培养瓶壁消化下来，再用含10%胎牛血清培养基配成单细胞悬液，调细胞密度2.5×104个/mL，每孔200μL，接种在96孔板中；(2)实验分组：空白对照组，Esculetin12.5μM，Esculetin25μM，Esculetin50μM(见表1)。每组设4个复孔；(3)细胞培养：37℃、5% CO2条件下培养，24h后换无血清DMEM培养液，继续孵育24 h后加入药物干预24h；(4)呈色：分别于药物作用结束前4h，每孔加5mg·mL- 1 MTT 20μL，4h后终止培养，吸弃孔内上清液，每孔加150μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min使结晶充分溶解；(5)比色：在酶标仪上490 nm波长处测定吸光度。
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1.4.2 巨噬细胞 RAW264.7分泌TNF-α、IL-6的检测
用含10%胎牛血清培养基培养RAW264.7细胞，细胞长满瓶底80%时，弃去培养基，加PBS液漂洗 2次；加入含胰酶和EDTA的消化液1-2ml，37℃消化约2min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化；弃消化液加PBS液漂洗 2次，加入新培养液10 ml，反复吹打混悬细胞，细胞密度调整为1×55/ml；以每孔 1ml细胞悬液将细胞接种到6孔板，每孔再加培养基4ml；然后将6孔板放入 5%CO2孵箱37℃培养24h，待细胞长满瓶底80%时(见图1)，弃去上清液，分别加入终浓度为0(空白对照)，12.5μM，25μM，50μM的含药培养基DMEM， 继续培养24h。收集每孔培养基2ml，1000r/min离心20 min，取上清液，放入-20℃保存，留作检测TNF-α、IL-6。TNF-α、IL-6的检测分别按TNF-α、IL-6ELISA试剂盒说明书操作，每组设复孔10个。
1.4.3 巨噬细胞RAW264.细胞NF-κB活化水平的检测
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(1)选择生长良好的巨噬细胞，胰蛋白酶制备细胞悬液，分入6孔板(选用其中4孔)，调整细胞密度，待细胞贴壁生长至80-90%汇合时，吸弃原含10%胎牛血清的培养液，换用无血清的DMEM培养液继续培养24h，使巨噬细胞同步化，处于G0/G1期。各实验组加入相应药物干预，对照组不处理，放入培养箱中继续培养，在24h后结束培养。取出6孔板，倒掉培养基，预冷的4℃PBS液润洗培养板2次，吸净残液，用细胞刮刀将细胞刮下，离心收集，加入细胞膜裂解液，混匀后冰浴15min，13000g离心15min，上清液作为胞浆蛋白提取物进行蛋白质印迹分析；沉淀用细胞膜裂解液洗涤一次，混悬于细胞核裂解液，混匀后-20℃冷冻过夜，13000g离心15min，上清液作为核蛋白提取物进行蛋白质印迹分析，用于分析NF-κB p65入核；(2)用BCA蛋白测定试剂盒说明书分别测定胞浆蛋白和核蛋白浓度；(3)SDS-PAGE凝胶电泳分离，电转移蛋白至PVDF膜，用5 %的脱脂奶粉在室温下封闭1h，洗膜后加入一抗在摇床孵育2h，然后4℃过夜，第二天洗膜后加入二抗在室温孵育2h，漂洗去除未结合的二抗，在暗室中进行显色。, 百拇医药(刘金 夏勇)