IGFBP5在神经管发育中的表达差异(1)
【摘 要】目的：探讨细胞增殖抑制因子IGFBP5在神经管发育中的作用并作初步功能分析。方法：比较胚胎9.5天、10.5天正常与同期NTD小鼠神经管组织的IGFBP5基因的表达差异，并对其进行了Northern杂交验证。结果：通过比较IGFBP5基因在正常E9.5d与E10.5d、 E9.5d- NTD、 E10.5d- NTD的表达差异，发现在正常神经胚形成前后IGFBP5表达显著上调， 在RA诱导致NTD(包括E9.5D与E10.5D两个时相)IGFBP5在RA作用后呈现下调趋势。结论：IGFBP5参与了正常神经管关闭的生理过程，在神经系统发育中的发挥重要作用，对基因的进一步研究有助于阐释NTD的发病机制。
【关键词】神经管 神经胚形成 基因芯片 维甲酸 IGFBP5
【中图分类号】R338 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2012)12-0323-02
, 百拇医药 神经管缺陷( neural tube defects， NTD) ， 是由于在胚胎发育过程中， 神经管闭合不全引起的一组缺陷。我国是已知世界神经管缺陷的高发国，神经管缺陷在所有出生缺陷中居首位。迄今对NTD发生的分子途径尚不了解，但对涉及此过程的基因表达与调控的研究较少[1]。实验比较了胚胎(embryonic，E)9.5天、10.5天正常与同期NTD小鼠神经管组织的IGFBP5基因表达差异，并对其进行杂交验证。以求发现此基因与NTD发生和神经胚的密切联系，并探讨其可能的分子调控途径。
1 材料与方法
1.1 动物分组和NTD模型建立：清洁级成年昆明种小鼠120只，55～65日龄，体质量22～28g，无特异病原体，雌雄各半(第三军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(渝)2007003)。60对成年昆明种小鼠，于18：00按雌雄1：1合笼，次日8：00取出，检查雌鼠阴道口有无阴栓。将发现阴栓者的当日早晨8：00定为孕期第0天(E0 d)， 16：00定为E0.5 d。60只孕鼠被随机分成维甲酸组(n = 30)和正常对照组(n = 30)。根据Klootwijk 等[2]的方法制备NTD模型。将维甲酸(retinoic acid， RA)溶于玉米油内(40 g/L)，按50mg/kg于孕期E7.0d～7.25d时一次性喂服孕鼠，制备NTD模型。同时正常对照组喂服等量玉米油。
, 百拇医药
1.2 标本采集和处理 在E9.5(n=16)、E10.5(n=12)时，处死正常及NTD孕鼠，剖腹取胎，在4倍解剖显微镜下确定已造成NTD发生，并分离胎盘、胎膜组织后，对鼠胚进行形态学辨别筛选，检查活胎数、死胎数以及每个胚胎头部、面部、脊柱、尾部等发育的外观特征，获得各阶段脑泡及脊神经组织。NTD的鉴定特征：解剖显微镜下观察典型的形态畸形包括颅脑顶部未闭呈现裂口、后脑及面部异常、脊柱或尾部有裂口及无尾或短尾等。挑选典型的异常神经管组织进行总RNA的分离和提取。
1.3总RNA的提取与检测 用TRIZOL试剂提取总RNA，分光光度仪检测RNA样本浓度，最后按约3.3μg/μL的浓度进行稀释分装，15μL/管(50μg)，-80℃保存。每组取总RNA 20μg， 1%琼脂糖胶电泳验证其纯度。
1.4基因芯片杂交与扫描分析：取50 μg总RNA，反转录合成cDNA，分别用2μL Cy3-dUTP(正常对照组)或Cy5-dUTP(维甲酸组)标记cDNA。参照蒋立坚等[3]的方法，用含有1100余个已知基因的中密度芯片对每组标记的cDNA杂交。杂交后芯片用ScanAr维甲酸y 4000扫描仪扫描获取微阵列图像，扫描图像经斯坦福大学ScanAlyze2.51软件分析。反复试验3次。
, http://www.100md.com
1.5 基因表达差异的评价标准：①当2组组织中基因表达的强度比值(Cy5/Cy3)大于2.0或小于0.5时，即认为它们存在差异表达，小于0.5者为维甲酸处理后下调基因，大于2.0者为上调基因。②3次重复实验中均出现相同趋势变化。③3次实验中有2次出现相同趋势改变且第3次结果不矛盾。
1.6 Northern杂交：取总RNA 20μg，经甲醛变性凝胶电泳后，毛细管法标记，按QIAquick探针纯化试剂盒(Qiagen，Maryland，USA)方法进行纯化，充分洗膜后，用感光胶片进行自显影，检测mRNA的相对含量。所有样膜用Actin cDNA探针(Incyte， Emeryville， California， USA.)再杂交，用作内参照。最后进行吸光度扫描，分析杂交信号。
2 结果
2.1 IGFBP5基因在不同组间的差异 分析正常神经管形成前后的IGFBP5基因表达，发现IGFBP5在神经管形成前后表达显著上调(cy5/cy3比值>2.0)，在RA诱导致NTD(包括E9.5D与E10.5D两个时相)出现的IGFBP5基因表达中，IGFBP5在RA作用后呈现下调趋势(RA处理E9.5 d cy5/cy3比值=0.4304<0.5；RA处理E10.5 d cy5/cy3比值=0.4752<0.5)。
, 百拇医药
2.2 Northern杂交验证结果：为了对芯片杂交的可靠性进行证实，对IGFBP5基因进行Northern杂交验证。结果均显示了与芯片结果相同的变化趋势。
3 讨论
IGFBP5作为IGF结合蛋白家族的一员，其作用与IGF密切相关，能延长IGF的半衰期，被认为与细胞增殖调控，细胞凋亡等多种生理过程有关，在脑发育中IGFBP5有较高表达，并参与小脑皮质的发育和海马形成等[4-5]。实验发现IGFBP5在维甲酸组表达下调，进一步证实该基因在神经系统发育中有特殊作用。但IGFBP5在神经系统发育中的作用尚不十分清楚。
分析正常神经管形成前后及RA诱导产生NTD后IGFBP5基因表达，发现IGFBP5在正常神经管组织中表达显著上调，在RA诱导致NTD(包括E9.5D与E10.5D两个时相)出现的IGFBP5基因表达中，IGFBP5在RA作用后呈现下调趋势。研究发现IGFBP5调节细胞的生长、分化、凋亡、黏附和运动，在调节肿瘤生长中发挥重要作用[6]，是一种具有抑制细胞凋亡功能的蛋白质[7]。IGFBP5也可以可激活caspase-8信号传导途径，增加病变组织对TNF-α的敏感性，诱导内在凋亡途径[8]，使肿瘤逃避机体的免疫监视，向着恶性方向发展。而在RA诱导致NTD(包括E9.5D与E10.5D两个时相)出现的IGFBP5基因表达中，IGFBP5在RA作用后呈现下调趋势。表明RA可能是通过降低IGFBP5的表达水平，在神经管关闭期间，细胞凋亡机制失调，监管机制失控，正常细胞不能有序分化，导致神经管的发育缺陷。, 百拇医药(李新军等)
【关键词】神经管 神经胚形成 基因芯片 维甲酸 IGFBP5
【中图分类号】R338 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2012)12-0323-02
, 百拇医药 神经管缺陷( neural tube defects， NTD) ， 是由于在胚胎发育过程中， 神经管闭合不全引起的一组缺陷。我国是已知世界神经管缺陷的高发国，神经管缺陷在所有出生缺陷中居首位。迄今对NTD发生的分子途径尚不了解，但对涉及此过程的基因表达与调控的研究较少[1]。实验比较了胚胎(embryonic，E)9.5天、10.5天正常与同期NTD小鼠神经管组织的IGFBP5基因表达差异，并对其进行杂交验证。以求发现此基因与NTD发生和神经胚的密切联系，并探讨其可能的分子调控途径。
1 材料与方法
1.1 动物分组和NTD模型建立：清洁级成年昆明种小鼠120只，55～65日龄，体质量22～28g，无特异病原体，雌雄各半(第三军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(渝)2007003)。60对成年昆明种小鼠，于18：00按雌雄1：1合笼，次日8：00取出，检查雌鼠阴道口有无阴栓。将发现阴栓者的当日早晨8：00定为孕期第0天(E0 d)， 16：00定为E0.5 d。60只孕鼠被随机分成维甲酸组(n = 30)和正常对照组(n = 30)。根据Klootwijk 等[2]的方法制备NTD模型。将维甲酸(retinoic acid， RA)溶于玉米油内(40 g/L)，按50mg/kg于孕期E7.0d～7.25d时一次性喂服孕鼠，制备NTD模型。同时正常对照组喂服等量玉米油。
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1.2 标本采集和处理 在E9.5(n=16)、E10.5(n=12)时，处死正常及NTD孕鼠，剖腹取胎，在4倍解剖显微镜下确定已造成NTD发生，并分离胎盘、胎膜组织后，对鼠胚进行形态学辨别筛选，检查活胎数、死胎数以及每个胚胎头部、面部、脊柱、尾部等发育的外观特征，获得各阶段脑泡及脊神经组织。NTD的鉴定特征：解剖显微镜下观察典型的形态畸形包括颅脑顶部未闭呈现裂口、后脑及面部异常、脊柱或尾部有裂口及无尾或短尾等。挑选典型的异常神经管组织进行总RNA的分离和提取。
1.3总RNA的提取与检测 用TRIZOL试剂提取总RNA，分光光度仪检测RNA样本浓度，最后按约3.3μg/μL的浓度进行稀释分装，15μL/管(50μg)，-80℃保存。每组取总RNA 20μg， 1%琼脂糖胶电泳验证其纯度。
1.4基因芯片杂交与扫描分析：取50 μg总RNA，反转录合成cDNA，分别用2μL Cy3-dUTP(正常对照组)或Cy5-dUTP(维甲酸组)标记cDNA。参照蒋立坚等[3]的方法，用含有1100余个已知基因的中密度芯片对每组标记的cDNA杂交。杂交后芯片用ScanAr维甲酸y 4000扫描仪扫描获取微阵列图像，扫描图像经斯坦福大学ScanAlyze2.51软件分析。反复试验3次。
, http://www.100md.com
1.5 基因表达差异的评价标准：①当2组组织中基因表达的强度比值(Cy5/Cy3)大于2.0或小于0.5时，即认为它们存在差异表达，小于0.5者为维甲酸处理后下调基因，大于2.0者为上调基因。②3次重复实验中均出现相同趋势变化。③3次实验中有2次出现相同趋势改变且第3次结果不矛盾。
1.6 Northern杂交：取总RNA 20μg，经甲醛变性凝胶电泳后，毛细管法标记，按QIAquick探针纯化试剂盒(Qiagen，Maryland，USA)方法进行纯化，充分洗膜后，用感光胶片进行自显影，检测mRNA的相对含量。所有样膜用Actin cDNA探针(Incyte， Emeryville， California， USA.)再杂交，用作内参照。最后进行吸光度扫描，分析杂交信号。
2 结果
2.1 IGFBP5基因在不同组间的差异 分析正常神经管形成前后的IGFBP5基因表达，发现IGFBP5在神经管形成前后表达显著上调(cy5/cy3比值>2.0)，在RA诱导致NTD(包括E9.5D与E10.5D两个时相)出现的IGFBP5基因表达中，IGFBP5在RA作用后呈现下调趋势(RA处理E9.5 d cy5/cy3比值=0.4304<0.5；RA处理E10.5 d cy5/cy3比值=0.4752<0.5)。
, 百拇医药
2.2 Northern杂交验证结果：为了对芯片杂交的可靠性进行证实，对IGFBP5基因进行Northern杂交验证。结果均显示了与芯片结果相同的变化趋势。
3 讨论
IGFBP5作为IGF结合蛋白家族的一员，其作用与IGF密切相关，能延长IGF的半衰期，被认为与细胞增殖调控，细胞凋亡等多种生理过程有关，在脑发育中IGFBP5有较高表达，并参与小脑皮质的发育和海马形成等[4-5]。实验发现IGFBP5在维甲酸组表达下调，进一步证实该基因在神经系统发育中有特殊作用。但IGFBP5在神经系统发育中的作用尚不十分清楚。
分析正常神经管形成前后及RA诱导产生NTD后IGFBP5基因表达，发现IGFBP5在正常神经管组织中表达显著上调，在RA诱导致NTD(包括E9.5D与E10.5D两个时相)出现的IGFBP5基因表达中，IGFBP5在RA作用后呈现下调趋势。研究发现IGFBP5调节细胞的生长、分化、凋亡、黏附和运动，在调节肿瘤生长中发挥重要作用[6]，是一种具有抑制细胞凋亡功能的蛋白质[7]。IGFBP5也可以可激活caspase-8信号传导途径，增加病变组织对TNF-α的敏感性，诱导内在凋亡途径[8]，使肿瘤逃避机体的免疫监视，向着恶性方向发展。而在RA诱导致NTD(包括E9.5D与E10.5D两个时相)出现的IGFBP5基因表达中，IGFBP5在RA作用后呈现下调趋势。表明RA可能是通过降低IGFBP5的表达水平，在神经管关闭期间，细胞凋亡机制失调，监管机制失控，正常细胞不能有序分化，导致神经管的发育缺陷。, 百拇医药(李新军等)