通督强脊“三步五法”对椎间盘胞外基质系统mRNA表达的影响(2)
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正常对照组为正常大鼠，正常饲养不作特殊处理，作为对照；模型组为造模的大鼠，不作其它特殊处理，作为对照。实验历经2个月。
1.4 指标检测
1.4.1 形态学观察
治疗结束次日，所有大鼠均用2%戊巴比妥钠按照50mg/kg的剂量腹腔注射过量麻醉处死大鼠。立即取出大鼠的L3—L6段脊柱，小心剥取带椎体的L3-4椎间盘组织，并将取下的L3/L4椎间盘组织放入4%多聚甲醛中固定，10%EDTA中脱钙，然后脱水透明，石蜡包埋，正中冠状切片，5μm厚，脱蜡进行HE染色，封片后在显微镜下观察椎间盘组织的形态，根据病理结果进行评分[5] (表2)。
1.4.2 分子生物学检测
取L4/L5、L5/L6椎间盘并剥离干净周围的肌肉组织，于液氮中研磨后用TRIzol法提取椎间盘组织的总RNA。根据标准RT-PCR操作流程：逆转录反应(RNA逆转录合成cDNA)；聚合酶链式反应(反应条件：95℃预热2 min；94℃ 30s，58℃ 45s，72℃ 60s，30个循环；72℃延伸5min)；凝胶电泳；BIO-RAD凝胶成像系统进行显影。检测椎间盘中collagenⅡ、TIMP-1、MMP-1、MMP-3 mRNA表达。
1.5 统计学分析
采用BIO-RAD凝胶成像系统采集琼脂糖凝胶电泳图像，运用Gel-pro软件计算mRNA条带的光密度(OD)值进行半定量分析，以目的基因与GAPDH的OD比值表示mRNA的表达水平。所有实验数据均采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料数据以x±s表示，各组间的实验数据采用单因素方差分析进行检验，方差齐性以LSD法分析，方差不齐以Games-Howell法分析，P<0 ......
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