汉坦病毒Ｓ片段荧光定量ＰＣＲ参考标准品的构建(2)
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参见附件(391KB，3页)。
1.2.3 连接至pMD18-T载体(大连宝生物公司)
① 连接PCR产物4 μL,pMD18-T Vector 1μL,Ligase Buffer 5 μL,16℃ 8 h。
② 转化：取出冻存的DH5α(200 μL/Tube)，冰中溶解,取5 μL连接液加入菌液中，轻轻混匀,冰浴30 min,42℃ 1.5 min,冰浴2 min,加入500 μL LB 37℃ 100 rpm 45 min,取200 μL涂布至Amp板(100 μg/mL),37℃倒置培养过夜，至克隆长出。
③ 扩增：取单克隆至3 mL Amp/LB中，37℃ 250 rpm，过夜。
④ 质粒抽提(V-gene 质粒抽提Kit)：质粒量为100 ng/μL。
1.2.4 测序 由测序结果可知T/A克隆序列正确(BigDye Mix，PE公司产品，测序引物为M13-F)。测序结果如下：
CTATAGAATNCAAGTTCAANGGCGAACTCTAGA
GATTatagccaggcagaaggtgagggatgcagaaaaacagtatgaaaaggatc
cagatgagttgaacaagagaacattaactgaccgagTgggcgttgcagtatctatc
caggcaaaaattgatgagttaaaaaggcaactggcagataggattgcaAATCG
TCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCG
TTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTAC
CCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCC
AGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGC
CCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGC
GCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGT
ATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCT
GCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACA
其中大写序列为载体序列，小写序列为目的基因(S-protein)序列。
1.2.5 计算 通过插入片段大小及载体大小计算质粒拷贝数, 将质粒定量以后稀释到1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104浓度梯度。
1.3 荧光定量PCR
① 引物设计：Primer-F:5′-ATAGCCAGGCAGA
AGGTGAG-3′； Primer-R:5′-TGCAATCCTATCTGC
CAGTT-3′。
② 探针设计Probe:5′Fam-ACATTAACTGACCG
AGAGGGCGTT-Tamra 3′。引物和探针为上海英骏生物技术有限公司合成,仪器为加拿大Funglyn公司的FTC2000型荧光定量PCR仪。
③加样体积：模板(DNA) 1μL，Buffer10X (含Mg2+ 20 mM) 5 μL，MgCl2(25 mM) 3 μL，dNTP 10 mM 1μL，Primer F (20 pmol/μL) 0.8 μL，Primer R (20 pmol/μL)0.8 μL，Probe(20 pmol/μL) 0.4 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL，H2O 33.5 μL至50 μL，反应条件：94℃ 3 min;(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s )45个循环。
2 结果
2.1 RT-PCR图谱
流行性出血热病人急性期血清的RT-PCR结果在1600 bp处有病毒总RNA的特异性条带出现(图1)。
泳道1、2、3分别是用不同样品得到的RT-PCR结果,泳道4为分子量marker: 条带大小从下到上依次是100、200、300、400、500、800、1000
图1 RT-PCR图谱
2.2 酶切图谱
在1300 bp处有明显条带出现(图2)。
[KH-1D]泳道1为标准品质粒XbaI+SalI酶切结果，泳道2 marker: 条带大小从下到上依次为200、300、500、700、1000
图2 酶切图谱
2.3 定量PCR扩增结果
扩增结果，各梯度之间间隔的Ct值相等，各梯度均能在一条直线上，标准曲线的相关系数在0.99以上(图3，4)。
[FK(W+36mm。40mm]
图3 标准品RT-PCR扩增曲线[HT][FK)][FK(W+36mm。42mm]
图4 标准曲线[FK)]
3 讨论
荧光定量PCR准确检测样品的前提是必需构建标准品，我们采用急性期病人的血清样品抽提RNA，经PCR扩增后产物纯化后用T4连接酶与PMD18T-Vector连接，连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌，经兰白斑平板筛选挑取单个白色菌落，培养后取质粒，经荧光定量PCR扩增证实构建成功。Ct值是指PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，反复预实验发现扩增平台期DNA扩增的拷贝数波动很大，重复性差，定量不准确，而Ct值都相对固定，重复性好，以不同浓度标准品DNA分别进行荧光定量PCR扩增，可以发现浓度越高，Ct值越小；DNA浓度增加1倍 ......
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