2006年上海监测点婴幼儿腹泻标本中诺如病毒基因分析(1)
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诺如病毒(Norovirus，NV)属于杯状病毒科(Human caliciviruses，HuCV)，是引起病毒性腹泻最常见的病原体之一。临床主要表现为恶心、呕吐、腹痛和腹泻。常年都有诺如病毒感染病例发生，发病高峰为秋冬季。各年龄段的人群都普遍易感。传播途径以粪-口感染为主，绝大部分病毒性腹泻局部爆发是食入被NV污染的食品或水源造成的。近5年里，发生过诺如病毒性腹泻爆发地区极为广泛，遍布美洲、欧洲、澳洲、亚洲等地 [1-7]。2006年底，日本大规模的诺如病毒爆发，引起世界强烈反响。我国也有诺如病毒性腹泻小规模爆发报道，北京、广东、山东、湖南、河北等地都曾有发生。就此，研究者对2006年2月—12月收集的监测点婴幼儿病毒性腹泻标本进行诺如病毒的核酸检测和序列测定，并和世界常见的GII1~GII8基因型诺如病毒参考株核酸序列以及世界各国2003—2006年公布的诺如病毒核酸序列进行比对，以了解本地区诺如病毒基因型别，分析其核酸变异情况。
1材料和方法
, 百拇医药 1.1阳性对照毒株
阳性对照毒株为中国疾病预防控制中心(中国CDC)腹泻室提供的含诺如GII型基因组病毒的大便悬液(阳性对照)。
1.2标本来源
89份标本来自于上海市松江区疾病预防控制中心(松江区CDC)2006年2月—12月送检的5岁以下，发病3日内，经临床实验室诊断为疑似病毒性腹泻标本。
1.3引物
引物采用杯状病毒289/290引物对[5]，由上海基康生物技术有限公司合成。
1.4病毒RNA提取
将腹泻标本制成20%粪悬液，以10 000 r/min离心10min，取上清140μL用于RNA提取。提取步骤参照试剂盒(QIAamp mini viral RNA kit，Qiagen公司)说明书，最后用60μL洗脱液洗脱RNA作为RT-PCR扩增模板。
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1.5核酸扩增
使用PCR扩增仪(PE 9700，美国ABI公司)完成核酸扩增。反应试剂(Promega公司)：10×buffer 5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(2.5mmol/L)5μL，引物对289/290(20μmol/L)各0.5μL，AMV逆转录酶(10U/μL)和TaqDNA聚合酶(5U/μL)各0.5μL，反应模板5μL，用无酶水补足反应总量至50μL。反应程序：42℃,30min逆转录，94℃预变性5min，随后进行35个循环的94℃ 45s变性；56℃ 45s复性；72℃ 1min延伸，最后72℃延长延伸时间至10min。取8μL扩增产物和2μL上样缓冲液混匀后在1.5%的琼脂糖凝胶上以100V恒压状态下电泳30min左右，通过凝胶成像仪(GIS2010，中国天能公司)观察319bp的特异性扩增条带。
1.6测序
, http://www.100md.com 送上海基康生物技术有限公司进行测序。
1.7诺如病毒核酸序列收集
收集世界公认的诺如病毒参考株序列，序列号分别为DQ078197、AF414424、AF080549、AF145896、X86557、AY587985、AB240190、AB240172、HCU07611、AY134748、HCU22498、AF414423、AF414409、AF414407、AB039780。同时收集2003—2006年NCBI/Genbank数据库中公布的诺如病毒RNA依赖的多聚酶(RdRp)核酸序列，序列号分别为AY900231、DQ288303、DQ078801、DQ440547、DQ288305、AB220924、EF126961、EF126962、AB240184、AB240188、DQ026456、AY 588028、EF126965、DQ157115、AY766290、EF121840、AY678468、EF126966、AJ626596、AY766273、DQ173774、DQ138990、AB291542、EF200697。
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1.8核酸序列分析
运用DNAStar生物基因分析软件包完成相关序列的同源性分析和基因遗传进化树绘制。
2结果
2.1核酸扩增
经一步法RT-PCR检测，送检的89份标本中有15份在319bp处出现诺如病毒特异性扩增条带(见图1)。
注：“1-2”为诺如病毒阳性标本核酸扩增产物，“3”为阳性对照标本核酸扩增产物，“4”为阴性对照标本核酸
2.2测序和比对
将15份RT-PCR扩增产物(编号为n1～15)送上海基康生物技术有限公司测序，获得测序结果12份。3份扩增条带由于浓度低，未完成测序。将12份测序结果递交NCBI/Genbank数据库进行BLAST搜索，均属于诺如病毒GII型基因组。2.3同源性分析及基因分析
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使用DNAstar软件包中MegAlign程序对世界公认的诺如病毒GII1~GII8基因型参考株核酸序列、2003—2006年NCBI/Genbank数据库公布的诺如病毒核酸序列及测序的12条诺如病毒核酸序列进行核酸同源性分析。比对结果显示，12条测序序列自身同源性范围在87.0%～99.0%之间。n1、n3、n4和EF 200697德国2006年公布的序列同源性最接近，同源性范围在80.0%～96.5%；其余9条测序序列和GII4参考株同源性最接近，并和DQ 026456中国公布的序列，和AB240190、AB220924、AB240184、AB240188日本2004—2005年公布的序列以及DQ440547、EF 126961、EF 126962荷兰2006年公布的序列同源性最接近，同源性范围均在82.2%～90.7%之间。
12条测序序列与世界公认的以及2003—2006年NCBI/Genbank数据库公布的共51条诺如病毒GII型基因组RNA依赖的多聚酶核酸(RdRp)序列进行基因遗传进化树的绘制(见图2)。结果显示，n1、n3、n4和EF 200697德国2006年公布的序列区别于其他序列，存在于单独的分支上，与其他比对序列差异较大。n2处于GII4和GII1基因型分支之间。其他测序序列在基因遗传进化树上所在的位置均在GII4所在分支范围内。
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3讨论
每年诺如病毒引起的急性胃肠炎散发病例和爆发事件在世界各国屡见不鲜。由于诺如病毒不易进行体外细胞培养，所以对其进行核酸检测是快速又简便的方法。由于289/290引物对可以扩增包括多种诺如病毒在内的多达25种型别的HuCV病毒而广泛被多国研究者采用，所以世界上目前普遍使用的检测杯状病毒的引物仍以该引物对为主。
诺如病毒核酸基因全长为7400~7700bp，分为3个读码框架(ORFs)，其中ORF1编码具有RNA多聚酶性质的非结构蛋白前体。诺如病毒核酸扩增区域主要在ORF1的C端与ORF2的N端，该区域是所有型别诺如病毒相对保守的位置[7]。NCBI/Genbank数据库公布的诺如病毒核酸序列同样证实了这个观点[4,6]。本次研究即采用ORF1靠近3’端位于4865~4590bp处编码RNA依赖的多聚酶核酸(RdRp)序列进行比对。和上海12株诺如病毒核酸序列进行比对的序列中25条来自于2003—2006年NCBI/Genbank数据库公布的包括中国在内的10个国家，另有14条序列为国际公认的GII1~GII8基因型诺如病毒参考株核酸序列。通过比对，n1、n3、n4和德国EF200697 2006年公布的GII型诺如病毒序列处于单独的分支上，与其他序列比较后显示较大的差异，同源性小于80.0%；n2处于GII4和GII1分支之间，但n2和GII4比对同源性较GII1更接近，达88.6%；其余测序序列在基因遗传进化树上所在的位置均在GII4分支上，同源性为82.2%～90.7%。, http://www.100md.com(滕 峥 张 曦 翁康生 邵俊杰 赵百慧)