液质联用法测定牛奶中5种β-内酰胺类抗生素(1)
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摘要： [目的] 建立采用LC-MS-MS分析牛奶中阿莫西林、氨苄西林、氯唑西林、苯唑西林和青霉素-G残留量的方法。
[方法] 牛奶样品中加入内标青霉素-D7，经乙腈沉淀后，离心并吸取上清液。上清液吹干后，通过固相萃取柱净化，然后进行检测。在液相色谱分离系统中，通过Atlantis C18柱，采用0.1%甲酸水溶液与乙腈不同比例混合的梯度流动相,根据以上各成分的不同质量数的碎片离子的强度,将5种抗生素分离并测定。 [结果] 在2～20 μg/L范围内，与内标的峰面积比有良好的线性关系。相关系数(R2)为0.9943～0.9981,在5、10 μg/L水平的标准加入回收率为88%～127%。阿莫西林、氨苄西林、青霉素、氯唑西林、苯唑西林的最低检测限量分别为5、2、2、4、4 μg/L (以信噪比为10∶1) 。 [结论] 该方法利用液-液萃取和固相萃取相结合的方法，并加入同位素内标，有效地去除干扰因素，为该类抗生素的测定提供了可靠、实用的测定方法。
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关键词： 液质联用法; β-内酰胺类抗生素; 牛奶中图分类号： O 657.63, TS 207.5文献标识码： A
Determination of five β-lactam antibiotics in milk by liquid chromatography-mass spectrometry SUN Pi, JIN Yu-e, WEN Yi-min, WANG Guo-quan(Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200336, China)
Abstract: [Objective] To develope a high performance liquid chromatography coupled mass spectrometry method based on C18 solid-phase extraction for simultaneous determination of five β-lactam antibiotics (amoxicillin，ampicillin，oxacillin，cloxacillin and penicillin G)in bovine milk.
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[Methods] The samples were cleaned up with C18 SPE catridge, the extracts were analyzed by liquid chromatography-electrosprapy ionization tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in the positive mode using a isotope-labeled internal standard.
[Results] The method was validated at the 5 and 10 μg/L level for these compounds in milk, and the limit of quantification was 5,2,2,4,4 μg/L for amoxicillin, ampicillin , penicillin G，cloxacillin and oxacillin, and the detection range was from 2 to 20 μg/L.
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[Conclusion]Liquid-liquid extraction and solid-phase extraction are combined to eliminate the interfering substance while the internal standard is used. Hence this method is adoptable for the determination of five kinds of antibiotics.
Key words: LC-MS/MS; β-lactam antibiotics; Milk
随着我国经济发展水平和生活水平的提高，牛奶逐渐成为中国城市居民日常生活中必不可缺的主要膳食成分之一。随之而来的牛奶中的抗生素残留问题也日益受到政府的重视。β-内酰胺类抗生素被广泛应用于兽药中，该类兽药的残留会引起敏感人群过敏。经常饮用含有残留抗生素的牛乳会诱导产生耐药菌株，给人类带来潜在的危害。欧盟和美国FDA等对上述抗生素的残留量都有严格的规定(表1)，并都有年度残留的监控计划。
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对牛乳中β-内酰胺类抗生素残留的分析较多的是采用传统的微生物法及高效液相色谱法(HPLC)等。HPLC法[1,2]常常需要衍生化反应，衍生化效率难于控制，其重现性不是很好。Sonja Riediker等[3]及Holstege等[4]分别采用LC—MS测定牛奶中内酰胺类抗生素残留，但前者的方法中操作步骤较繁琐，后者采用的内标是有可能存在的同类抗生素。我们参考两者的测定方法，研究建立了牛奶中5种残留抗生素的测定方法。
1 实验部分
1.1 主要仪器、试剂与材料
Waters 2695-Quttro Primier高效液相色谱仪-质谱仪；色谱柱为Waters 公司的Atlantis C18 (150 mm×2.1 mm,3.5 μm)色谱柱；离心机( 瑞江RJ-TDL-5A)；氮吹仪( ZymarkTurboVap LV EVAPORATOR)；固相萃取仪(SUPELCO Visi PREP DLTM)；Milli—Q超纯水器(美国Milliporeco公司)； IKA MS1型旋涡混合仪；固相萃取柱(Waters oasis HLB 3cc)。
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标准品阿莫西林、氨苄西林、青霉素、氯唑西林钠、苯唑西林钠(纯度为99% )及同位素内标(青霉素-D7)均购自Dr. Ehrenstorfer 公司。
标准储备液的配制：分别称取阿莫西林、氨苄西林、氯唑西林钠、苯唑西林钠及青霉素G各10 mg，用水溶液溶解并定容至10 mL。各储备液浓度均为1.0 mg/mL。于冰箱中-20℃储存。青霉素-D7内标溶液的配置：准确称取10 mg内标，用50%甲醇定容至10 mL棕色瓶中，混匀，于冰箱中-20℃储存。乙腈、甲酸及磷酸二氢钠均为分析纯。牛奶为市售产品。
1.2 实验方法
1.2.1 样品的处理 取5 mL牛奶置于50 mL离心管中，加入20 μL浓度为1 μg/mL的内标物，加入5 mL乙腈并涡旋1 min，再加入10 mL乙腈，充分摇匀，然后3 000 rpm离心5 min。吸取上层清液10 mL于60℃下用氮气吹近干，加入3 mL磷酸盐缓冲液(pH=4.5)。超声溶解。将该溶液注入平衡好的HLB(先用3 mL甲醇洗涤小柱，然后再用3 mL水淋洗)，先用水淋洗，然后用3 mL60%乙腈洗脱。收集洗脱后氮吹至干，用0.5 mL乙腈∶0.1%甲酸水(1∶1)溶解，15 000 rpm离心，上清液供液相色谱-质谱仪进行检测。, 百拇医药(孙 丕 金玉娥 温忆敏 汪国权)