上海市虹口区外环境霍乱弧菌监测分析(1)
(上海市虹口区疾病预防控制中心)
摘要: [目的] 了解水体和水产品中霍乱弧菌污染情况。[方法] 2008-2010年按照国家监测方案采集国家监测点水体和水产品, 用增菌、分离培养方法检测O1 群霍乱弧菌和O139 群霍乱弧菌。对分离到的菌株，以PCR方法,对霍乱弧菌菌株进行ctxA毒力基因检测。[结果]3 年合计,从720 份水体中检出6 株霍乱弧菌, 在370 份水产品中未检出霍乱弧菌。6株霍乱弧菌中5株为O1 群霍乱弧菌非流行株(小川型2 株、稻叶型3 株)，1株为O139 群霍乱弧菌流行株。3株稻叶型霍乱弧菌不是产毒株，其余均为产毒株。[结论] 2008-2010年上海市虹口区外环境中的霍乱弧菌主要是O1 群非流行株，但仍有ctx阳性产毒株。
霍乱是由O1血清群和O139血清群霍乱弧菌引起的急性肠道传染病, 是以发病急、传播快、波及范围广、能引起大流行为特征的国际检疫传染病之一,也是中国法定的甲类传染病之一。霍乱弧菌广泛存在于近海岸的水体和水产品中,其中O1 群和O139 群霍乱弧菌是霍乱的致病菌。上海市虹口区是国家级霍乱监测点，本文对2008-2010年, 上海市虹口区按照国家监测方案采集国家监测点水体和水产品,检测O1 群霍乱弧菌和O139 群霍乱弧菌，了解和掌握本地区水体和水产品霍乱弧菌的污染情况，为霍乱的有效防控提供实验室依据。
, 百拇医药
1材料与方法
1.1样品来源
2008-2010年,虹口区采集国家监测点水体720份和水产品370份。见表1
表12008-2010年样品分类
年份
水产品
水体
海鱼
河鱼
贝壳类
虾蟹类
合计
, 百拇医药
河水
江水
污水
养殖水
合计
2008
54
22
31
33
140
96
48
24
, 百拇医药
72
240
2009
52
24
24
20
120
96
48
24
72
240
2010
, 百拇医药
44
24
32
20
120
96
48
24
72
240
1.2试剂及仪器
碱性蛋白胨水、“双洗”琼脂、O1群霍乱弧菌多价、小川、稻叶、O139群诊断血清购自上海疾控华康科技开发公司；5种抗生素药敏纸片由OXOID生产；M H琼脂由科玛嘉公司生产；氧化酶试剂、革兰染液、ID32E生化反应鉴定条(法国生物梅里埃公司)，均在有效期内使用。
, http://www.100md.com
1.3检测方法
按《霍乱防治手册》(第五版)要求,对采集样品进行增菌、培养、鉴定。样品前处理方法:对于鱼类样品采集鳃部和/或肠内容物以无菌操作剪碎后置碱性胨水培养;贝壳、甲壳类样品,如为细小动物,则将样品打碎后,取25～50 g左右,置碱性蛋白胨水中增菌培养;以肛门、鱼鳃及体表涂抹法为主的海(水)产品,并结合整体或部分采集法开展,以无菌棉签涂抹水生动物肛门、鱼鳃及体表,置碱性胨水培养。36℃ ±1℃培养6～8 h后,取菌膜下培养物划线接种“双洗”琼脂及碱性营养琼脂挑取可疑菌落进行革兰染色镜检、氧化酶反应、生化试验, 同时用霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。
1.4PCR检测
PCR检测霍乱弧菌毒力基因ctxA试剂盒由上海宝生科技有限公司提供。扩增条件及具体操作均按试剂说明书进行。
1.5药敏试验方法
, http://www.100md.com
采用WHO推荐的改良K - B纸片法。药敏纸片包括:环丙沙星(CIP) 、诺氟沙星(NOR)、丁胺卡那霉素(AN)、复方新诺明( SXT) 、强力霉素(DO)。实验所用的药敏质控菌株大肠埃希氏菌ATCC25922为上海市疾控中心微生物实验室提供,结果判断按照2008美国国家临床实验室标准化委员会(CLSI)文件规定。
2结果
2.1检验结果
2008-2010年,本区共采集国家监测点水体720份和水产品370份。在720份水体样品中分离检测出6株霍乱弧菌(均来自养殖水)，从370 份水产品中未检出霍乱弧菌。6株霍乱弧菌中5株为O1 群霍乱弧菌非流行株(小川型2 株、稻叶型3 株)，1株为O139 群霍乱弧菌流行株。3株稻叶型霍乱弧菌不是产毒株，其余均为产毒株。具体结果见表2。
表2 6株霍乱弧菌分型结果
, 百拇医药
年份
检测养殖水样品数
检测阳性数
菌株型别
2008
72
1
O1群稻叶型
2009
72
2
O1群稻叶型
2010
, 百拇医药
72
3
1株O139群，2株O1群小川型
合计
216
6
2.2 霍乱弧菌菌株的鉴定
该菌的生物学特性为： 革兰阴性无芽孢、短小弧菌， 在碱性蛋白胨水中，6 h即在液面形成菌膜， 在“双洗”琼脂平板上形成圆形、扁平、微带灰色半透明、表面光滑湿润菌落。氧化酶试验、生化及嗜盐性鉴定， 结果符合霍乱弧菌生化特性。生化及嗜盐性试验结果见表3。
表36株霍乱弧菌生化及嗜盐性试验结果
, http://www.100md.com
氧化酶
赖氨酸
鸟氨酸
精氨酸
葡萄糖
蔗糖
阿拉伯糖
甘露醇
山梨醇发酵
0% NaCI
3% NaCI
6% NaCI
8% NaCI
, http://www.100md.com
10% NaCI
稻叶型(3株)
+
+
+
-
-
+
-
+
快
+
+
-
, http://www.100md.com
-
-
小川型(2株)
+
+
+
-
-
+
-
+
1快
1慢
+
, 百拇医药
+
-
-
-
O139群(1株)
+
+
+
-
-
+
-
+
慢
, 百拇医药
+
+
-
-
-
血清学试验： 6株菌株与霍乱弧菌O1+O139多价血清凝集试验均为阳性， 并分别与O139、小川、稻叶诊断血清的凝集试验分别为阳性，同时用生理盐水对照， 无自凝现象。
2.3 ctx毒力基因测定
以霍乱弧菌主要毒力因子基因ctxA为目标基因,对所有菌株均进行了PCR扩增。电泳结果显示O139群霍乱弧菌流行株及O1群小川型霍乱弧菌非流行株全部扩增出与阳性对照条带一致的霍乱毒素ctxA目标基因。阴性对照则无条带出现。(见图1)
, 百拇医药 图16株霍乱弧菌PCR扩增结果
1-2：小川型；3：O139群；4-6：稻叶型；7：阳性对照；8：阴性对照
2.4 药敏试验结果(见表4)
表4O1群和O139群霍乱弧菌对5种药物敏感试验结果
抗生素
O1群 (5)
O139 (1)
CTX + (2)
CTX - (3)
CTX +
S
, 百拇医药
R
S
R
S
R
环丙沙星
2
0
3
0
1
0
诺氟沙星
2
, http://www.100md.com
0
3
0
1
0
丁胺卡那霉素
2
0
3
0
1
0
复方新诺明
2
, http://www.100md.com
0
3
0
0
1
强力霉素
2
0
3
0
0
1
2.5 噬菌体裂解试验：5株为O1 群霍乱弧菌由上海市疾控中心微生物实验室检验鉴定为非流行株，噬菌体生物分型为32k、9k、9k、26e、26k。
3讨论
霍乱弧菌广泛存在于世界各地的江河湖海水体及水生动植物中，水及水产品在霍乱的传播及流行中起着重要作用。O1 群和O139 群霍乱弧菌可引起霍乱的发病与流行，非O1 群非O139 群霍乱弧菌则可引起以血样便和黏液便为特征的腹泻病散发和局部暴发。从外环境中检测霍乱弧菌及其毒素对监测霍乱在人群中的传播和流行具有十分重要的意义。, 百拇医药(张静 陈真 唐漪灵 沈静 王姗 姚红)
摘要: [目的] 了解水体和水产品中霍乱弧菌污染情况。[方法] 2008-2010年按照国家监测方案采集国家监测点水体和水产品, 用增菌、分离培养方法检测O1 群霍乱弧菌和O139 群霍乱弧菌。对分离到的菌株，以PCR方法,对霍乱弧菌菌株进行ctxA毒力基因检测。[结果]3 年合计,从720 份水体中检出6 株霍乱弧菌, 在370 份水产品中未检出霍乱弧菌。6株霍乱弧菌中5株为O1 群霍乱弧菌非流行株(小川型2 株、稻叶型3 株)，1株为O139 群霍乱弧菌流行株。3株稻叶型霍乱弧菌不是产毒株，其余均为产毒株。[结论] 2008-2010年上海市虹口区外环境中的霍乱弧菌主要是O1 群非流行株，但仍有ctx阳性产毒株。
霍乱是由O1血清群和O139血清群霍乱弧菌引起的急性肠道传染病, 是以发病急、传播快、波及范围广、能引起大流行为特征的国际检疫传染病之一,也是中国法定的甲类传染病之一。霍乱弧菌广泛存在于近海岸的水体和水产品中,其中O1 群和O139 群霍乱弧菌是霍乱的致病菌。上海市虹口区是国家级霍乱监测点，本文对2008-2010年, 上海市虹口区按照国家监测方案采集国家监测点水体和水产品,检测O1 群霍乱弧菌和O139 群霍乱弧菌，了解和掌握本地区水体和水产品霍乱弧菌的污染情况，为霍乱的有效防控提供实验室依据。
, 百拇医药
1材料与方法
1.1样品来源
2008-2010年,虹口区采集国家监测点水体720份和水产品370份。见表1
表12008-2010年样品分类
年份
水产品
水体
海鱼
河鱼
贝壳类
虾蟹类
合计
, 百拇医药
河水
江水
污水
养殖水
合计
2008
54
22
31
33
140
96
48
24
, 百拇医药
72
240
2009
52
24
24
20
120
96
48
24
72
240
2010
, 百拇医药
44
24
32
20
120
96
48
24
72
240
1.2试剂及仪器
碱性蛋白胨水、“双洗”琼脂、O1群霍乱弧菌多价、小川、稻叶、O139群诊断血清购自上海疾控华康科技开发公司；5种抗生素药敏纸片由OXOID生产；M H琼脂由科玛嘉公司生产；氧化酶试剂、革兰染液、ID32E生化反应鉴定条(法国生物梅里埃公司)，均在有效期内使用。
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1.3检测方法
按《霍乱防治手册》(第五版)要求,对采集样品进行增菌、培养、鉴定。样品前处理方法:对于鱼类样品采集鳃部和/或肠内容物以无菌操作剪碎后置碱性胨水培养;贝壳、甲壳类样品,如为细小动物,则将样品打碎后,取25～50 g左右,置碱性蛋白胨水中增菌培养;以肛门、鱼鳃及体表涂抹法为主的海(水)产品,并结合整体或部分采集法开展,以无菌棉签涂抹水生动物肛门、鱼鳃及体表,置碱性胨水培养。36℃ ±1℃培养6～8 h后,取菌膜下培养物划线接种“双洗”琼脂及碱性营养琼脂挑取可疑菌落进行革兰染色镜检、氧化酶反应、生化试验, 同时用霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。
1.4PCR检测
PCR检测霍乱弧菌毒力基因ctxA试剂盒由上海宝生科技有限公司提供。扩增条件及具体操作均按试剂说明书进行。
1.5药敏试验方法
, http://www.100md.com
采用WHO推荐的改良K - B纸片法。药敏纸片包括:环丙沙星(CIP) 、诺氟沙星(NOR)、丁胺卡那霉素(AN)、复方新诺明( SXT) 、强力霉素(DO)。实验所用的药敏质控菌株大肠埃希氏菌ATCC25922为上海市疾控中心微生物实验室提供,结果判断按照2008美国国家临床实验室标准化委员会(CLSI)文件规定。
2结果
2.1检验结果
2008-2010年,本区共采集国家监测点水体720份和水产品370份。在720份水体样品中分离检测出6株霍乱弧菌(均来自养殖水)，从370 份水产品中未检出霍乱弧菌。6株霍乱弧菌中5株为O1 群霍乱弧菌非流行株(小川型2 株、稻叶型3 株)，1株为O139 群霍乱弧菌流行株。3株稻叶型霍乱弧菌不是产毒株，其余均为产毒株。具体结果见表2。
表2 6株霍乱弧菌分型结果
, 百拇医药
年份
检测养殖水样品数
检测阳性数
菌株型别
2008
72
1
O1群稻叶型
2009
72
2
O1群稻叶型
2010
, 百拇医药
72
3
1株O139群，2株O1群小川型
合计
216
6
2.2 霍乱弧菌菌株的鉴定
该菌的生物学特性为： 革兰阴性无芽孢、短小弧菌， 在碱性蛋白胨水中，6 h即在液面形成菌膜， 在“双洗”琼脂平板上形成圆形、扁平、微带灰色半透明、表面光滑湿润菌落。氧化酶试验、生化及嗜盐性鉴定， 结果符合霍乱弧菌生化特性。生化及嗜盐性试验结果见表3。
表36株霍乱弧菌生化及嗜盐性试验结果
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氧化酶
赖氨酸
鸟氨酸
精氨酸
葡萄糖
蔗糖
阿拉伯糖
甘露醇
山梨醇发酵
0% NaCI
3% NaCI
6% NaCI
8% NaCI
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10% NaCI
稻叶型(3株)
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+
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小川型(2株)
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1快
1慢
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+
-
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O139群(1株)
+
+
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+
-
+
慢
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-
-
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血清学试验： 6株菌株与霍乱弧菌O1+O139多价血清凝集试验均为阳性， 并分别与O139、小川、稻叶诊断血清的凝集试验分别为阳性，同时用生理盐水对照， 无自凝现象。
2.3 ctx毒力基因测定
以霍乱弧菌主要毒力因子基因ctxA为目标基因,对所有菌株均进行了PCR扩增。电泳结果显示O139群霍乱弧菌流行株及O1群小川型霍乱弧菌非流行株全部扩增出与阳性对照条带一致的霍乱毒素ctxA目标基因。阴性对照则无条带出现。(见图1)
, 百拇医药 图16株霍乱弧菌PCR扩增结果
1-2：小川型；3：O139群；4-6：稻叶型；7：阳性对照；8：阴性对照
2.4 药敏试验结果(见表4)
表4O1群和O139群霍乱弧菌对5种药物敏感试验结果
抗生素
O1群 (5)
O139 (1)
CTX + (2)
CTX - (3)
CTX +
S
, 百拇医药
R
S
R
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环丙沙星
2
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诺氟沙星
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0
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丁胺卡那霉素
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复方新诺明
2
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0
3
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1
强力霉素
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1
2.5 噬菌体裂解试验：5株为O1 群霍乱弧菌由上海市疾控中心微生物实验室检验鉴定为非流行株，噬菌体生物分型为32k、9k、9k、26e、26k。
3讨论
霍乱弧菌广泛存在于世界各地的江河湖海水体及水生动植物中，水及水产品在霍乱的传播及流行中起着重要作用。O1 群和O139 群霍乱弧菌可引起霍乱的发病与流行，非O1 群非O139 群霍乱弧菌则可引起以血样便和黏液便为特征的腹泻病散发和局部暴发。从外环境中检测霍乱弧菌及其毒素对监测霍乱在人群中的传播和流行具有十分重要的意义。, 百拇医药(张静 陈真 唐漪灵 沈静 王姗 姚红)