镉饱和法对大鼠肝脏和血浆金属硫蛋白测定方法研究
 |
| 第1页 |
参见附件。
摘要 目的：探索镉(Cd)饱和法测定大鼠肝脏和血液金属硫蛋白(Metallothionein，MT)的条件。方法：建立镉饱和法测定MT加血红蛋白的沉降次数；镉饱和法测定MT的标准曲线；镉饱和法测定MT的精确度；测定大鼠血浆和肝脏MT含量。结果： Cd饱和法在测定过程中，加血红蛋白后的最佳沉降次数为3次。对两组同一样品分别进行5次测定，其变异系数分别为4.86%和0.95%。用已知浓度MT溶液作精密度实验，可见线性关系(r=0.9991，p<0.01)。标准回收率范围为97.2～104.3%。测定得到大鼠肝脏MT含量为36.78±4.85(?g/g)，血中MT含量为543.34±55.42 (?g/ml)，结论：Cd饱和法测定动物组织中的MT，具有较好的重复性，而且该法简便、快捷、经济。因此该法可在大规模调查使用。
关键词 镉饱和法 大鼠肝脏 金属硫蛋白
金属硫蛋白(Metallothionein，简称MT)是一类广泛存在于生物体内的低分子量(约6000～7000道尔顿)、富含半胱氨酸、缺少环状氨基酸的金属结合蛋白，每摩尔MT可以结合6～12个Zn、Cd、Cu、Hg和Ag等重金属[1] [6]。结合了二价金属镉离子的MT在250nm处有特殊的光吸收峰[2]。金属硫蛋白参与体内微量元素的储存、转运和代谢，具有拮抗电离辐射、清除自由基以及重金属解毒的作用，还与机体生长发育、延缓衰老及某些疾病有关[3]。现在测定MT的方法较多，有镉/血红蛋白亲和分析法(简称镉饱和法)[4]、银饱和法、电化学法、免疫法、色谱分析法、蛋白质印迹分析法、巯基显色法和偶联技术等[3-4]。其中镉饱和法无需特殊的试剂和设备，而且周期短、消耗少，比较适合大量研究使用[4]。本研究通过镉饱和法测定大鼠肝和血中的金属硫蛋白，有简便、快速、不用同位素镉，灵敏度较好的优点。
1.材料及方法
1.1 主要仪器及试剂
1.1.1仪器：10ml离心管数支；容量瓶100ml，250ml，500ml；移液器50-200?l，200-1000?l；旋涡混匀器，型号QC-901，江苏海门市麒麟医用仪器厂；电热恒温水箱；DY89-I型电动玻璃匀浆机，宁波新芝科器研所；LD5-2A型离心机，5000r/min，北京医用离心机厂；GF95原子吸收分光光度计光谱仪。
1.2 实验动物
选用健康雌性SD大鼠40只，大鼠合格号SCSK(川)2004-15，体重约250～300g，标准饲料喂养，每日用针筒灌喂一次，未接触重金属，取标本时34只一般状况良好，6只在喂养期间死亡。采眼球血及肝脏备用。
1.3 样品预处理
1.3.1 取大鼠肝脏数克置于匀浆管，加4倍tris-HCl缓冲溶液，在匀浆机上匀浆数分钟，待匀浆完成后，将匀浆液倒入离心管中，10000r/min离心20分钟，取上清液备用。
1.3.2 将取得的大鼠血在3000r/min离心机上离心8min，取上清液备用。
1.4 MT的测定方法
1.4.1 测定原理：本方法原理基于MT与二价镉离子结合后，很难被其他金属置换下来，且使Cd-MT发生50%解离的pH值为2.5～3.5[5]。因此本法在加入CdCl2溶液后，用pH=8的Tris-HCl缓冲液调节PH值，使二价镉离子充分与MT结合后，剩余的游离镉用牛血红蛋白结合，经加热离心而沉淀下来，再测定与MT结合的金属镉的量。后根据每分子Cd与3个巯基结合，即一分子MT和6分子镉结合，计算MT的含量。
1.4.5 数据处理 数据采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析。
2. 结果
2.1 最佳离心次数的确定
在1.4.2操作步骤中，进行②步骤2～5次，其结果见表1。表1的数据表明，离心3次后上清液中Cd含量明显低于2次离心后，差异明显(P<0.05)，无实际意义；离心3次结果与离心4次、5次结果比较，P>0.05，说明离心3次与4、5次相比，结果无差异。因此认为，经过离心3次后，游离镉基本被除去，实验选择离心三次为最佳。
2.2 金属硫蛋白的标准曲线
2.3 回收实验
分别取同一只预处理过的大鼠血液(0.5ml)置于6支试管中，按表3分别加入一定量的标准MT，并按上述方法处理，进行MT测定的回收实验，由表3所示结果可见标准MT回收率范围为：97.2～104.3%，表明该方法具有较好的重复性。
2.4 精密度检验
分别取两组大鼠肝脏匀浆备用液样品各5个，进行重复实验。按照上文所述的测定，进行MT含量的测定实验。结果见表3。
2.5 肝脏和血浆金属硫蛋白的测定及与文献测得值比较
根据上述方法，对大鼠(健康雄性普通大鼠，合格号SCSK(川)2004-15，体重约150-250g)的肝脏MT进行了测定，所得MT值为36.78±4.85(?g/g)；血浆中MT值为543.34±55.42 (?g/ml)。
本实验测得的肝脏中的结果与文献测得值比较，结果位于文献报道之间，考虑到金属硫蛋白在组织中含量变异较大，该结果可接受。而本实验测得血浆中的结果远高于文献报道的结果，可能原因为为该实验所用大鼠为长期不间断灌胃应急状态下，产生了高于常态数倍的MT。
3. 讨论
现报道的MT的测定方法中， 汞饱和法迅速而简便，但是由于汞的加入量极其重要，加入量过小，导致测定结果偏低，加入量过大，导致测定结果偏高，所以难以掌握[4]；放射免疫分析法敏感性和特异性强，灵敏度高，检出范围为0.1～300ng/ml。缺点是要求实验室具备一定的放射免疫技术和设备条件，大规模调查成本较高[9]。酶联免疫吸附法离大幅推广应用还有一定距离 [9] 。而本文研究的方法简便、快速、不用同位素镉，灵敏度较好，检测限为40ng [4]。
由于金属硫蛋白在体内微量元素的代谢、重金属中毒的代谢、毒效应发挥与解毒过程中起着极为重要的作用[10]，且金属硫蛋白的基因结构高度保守，在表达上具有高度可诱导性[8]，因此金属硫蛋白在组织中含量变化较大，正常组织和体液中的金属硫蛋白的确切含量还未见报道。
该实验由于要经过多次离心及转移上清液去沉淀处理，而容易误差，因此在实验中要特别注意在转移上清液时尽量彻底，以减小误差。
参考文献
[1] 安建平，王廷璞，邹亚丽，等.镉诱导黄瓜金属硫蛋白的分离、纯化和鉴定[J].安徽农业科学，2008，36(18)：7514-7515，7742.
[2] 卢圣勋，梁贵友 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(1934kb)。