mGluR1在苯并(a)芘致神经细胞损伤中的表达(1)
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【摘要】目的 研究代谢型谷氨酸受体第1亚型(mGluR1)在苯并(a)芘(Benzo[a]pyrene,B[a]P)染毒大鼠脑神经细胞中的表达情况。方法 通过体外培养大鼠神经细胞并用不同浓度B[a]P染毒,分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,观察细胞的生长状况和分子生物学改变。①光镜观察神经细胞的形态学变化;② RT-PCR法检测mGluR1基因的表达情况。结果 ①光镜下可见神经细胞形态改变,随B[a]P剂量的加大可见神经细胞的突触数量明显减少、突触长度缩短和神经细胞包体间以及包体与突触间的连接减少;②与对照组相比,各组mGluR1基因的检测结果无统计学意义(P>0.05),各剂量组对照组相比随着B[a]P剂量的加大mGluR1的表达有上升趋势。结论 ①B[a]P能够诱导神经细胞的损伤,且其损伤程度与B[a]P的作用剂量有密切关系;② mGluR1在苯并(a)芘致学习记忆损伤的机制中可能不起主要作用。
【关键词】苯并(a)芘;mGluR1;神经细胞损伤
中国分类号:R114文献标识号:A 文章编号:1005-0515(2010)10-060-03
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是人类最早发现的环境污染物和致癌物质,普遍存在于空气、食物和饮用水中。苯并(a)芘作为PAHs的主要代表之一,主要来源于煤、木材、油和烟草的不完全燃烧,广泛存在于烹调油烟冷凝物、油烟颗粒物以及烧烤烤肉等食物中,不仅有致癌性,导致DNA损伤,而且与人群生殖健康以及不良出生结局的发生有密切关系[1]。苯并(a)芘可以对职业接触人群的学习,记忆,感知觉等产生不利的影响[2] 。B[a]P对学习记忆功能有损伤作用,可能与神经细胞凋亡有关。mGluR1是学习记忆过程中的重要信号分子,与神经细胞的凋亡也密切相关。因此,本课题主要通过动物神经细胞体外培养途径,研究mGluR1在B[a]P染毒SD大鼠脑神经细胞中的表达情况,观察mGluR1在苯并(a)芘致学习记忆损伤中的作用机制中是否起主要作用。
1 实验材料
1.1药物与试剂
DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培养基购自Gibico公司;胰酶(Trypsin)购自北京邦定生物医学公司;多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine, MW 30000-70000)购自Sigma公司;谷氨酰胺,购自北京夏斯生物公司;HEPES购自北京拜尔迪生物公司; Cell Counting Kit–8,购自日本同仁化学研究所; RNAiso Plus;Tris,购自上海生工生物工程有限公司;mGluR1及β-actin引物序列均由北京赛百盛公司设计合成; cDNA第一链合成试剂盒、PCR扩增试剂盒均购自太原市东弘科贸有限公司。
1.2 实验仪器
①二氧化碳培养箱德国Heraeus 公司生产;②SW-CJ-2F型超净工作台苏州安泰空气技术有限公司生产;③ KY-I 型微型空气压缩机 绍兴市卫星医疗设备制造有限公司生产;④80-2B型离心沉淀机 盐城市科学仪器厂;⑤LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器 江阴滨江医疗设备厂;⑥Neofuge 15R台式高速冷冻机 上海力申科学仪器有限公司;⑦EDC-810型基因扩增仪 东胜创新生物科技有限公司; ⑧DYY-8C型电泳仪,DYC-40C型电泳槽 北京市六一仪器厂;⑨专业数码凝胶成像与分析系统 3.3 江苏捷达科技;⑩AB104-N电子天平上海电子仪器厂生产。
2 方法与结果
采用新生1-3天的SD大鼠(由山西医科大学实验动物中心提供),在无菌条件下取出脑皮质并用0.25%胰酶消化,以1×105密度接种神经细胞,培养5天。用B[a]P对细胞染毒,分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,使其终浓度为0μmol/L、10μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L,继续培养48h ,观察细胞的生长状况。①光镜观察神经细胞的形态学变化;② RT-PCR法检测mGluR1基因的表达情况。实验结果用均数±标准差( ) 表示, 用SPSS for 11.0 版本软件进行统计学分析,采用单因素F 检验判断均数差异显著性。
2.1神经元细胞染毒后形态学变化
在光学显微镜下观察神经细胞可见,对照组神经细胞具有呈圆锥形的长突起,轴突长且比较均一,树突数量多,细胞与突触间,胞体与胞体间连接丰富。低剂量组在形态上仅见包体变大,部分神经元轴突变短,细胞间连接减少。中剂量组神经元的细胞变形,轴突变短,且树突的数量减少,细胞与突触间,胞体与胞体间连接减少。高剂量组神经元树突数量进一步减少,轴突减少变短,细胞与突触间,胞体与胞体间连接明显减少;见图1-5。
2.2 mGluR1的RT-PCR检测结果
由表2数据可知,经统计学分析各均数间无差异,但除中剂量组外,与对照组相比mGluR1基因的表达量随着B[a]P剂量的增大有上升趋势。
3 讨 论
苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene,B[a]P)是一种常见的环境化学致癌物,可通过生物链累积。B[a]P及其代谢物可透过血脑屏障,也可通过嗅神经直接进入大鼠脑组织,并在小脑等部位蓄积[3],引起神经递质含量及其代谢酶活性的改变,致全脑单胺能、多巴胺能和血清素能系统变化,导致行为和激素分泌障碍 。B[a]P作为一种慢性神经毒性物质,可使神经系统发生退行性改变,已经被许多动物实验所证实。Andersson等发现汽车尾气提取物(含B[a]P)注射大鼠海马及脑干部位可造成组织细胞损伤[4]。波兰的一项调查表明,焦化工人出现神经官能症,伴有植物神经系统的调节紊乱,并出现短期记忆的缺失,其严重程度与接触B[a]P的水平有关[5]。整体动物实验脑室注射苯B[a]P可显著性的引起海马神经细胞的减少,随着所给B[a]P剂量增加海马神经细胞凋亡增多。本研究中在以不同浓度的B[a]P染毒大鼠神经细胞时,光镜下可见细胞形态改变,B[a]P作用剂量的加大可见神经细胞突触长度明显缩短,并且神经细胞间和细胞与突触间的连接数量及损伤程度也与B[a]P的剂量有着密切的关系。说明B[a]P的作用可以导致神经细胞损伤,并且损伤的程度与B[a]P的作用剂量有着密切的关系。
谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统内的主要神经递质,约50% 的谷氨酸参与调节中枢神经系统内的突触传递,几乎可调节正常脑内的所有功能,包括学习、记忆、运动、认知和发育,并与神经细胞的存活、突触的形成及可塑性密切相关。代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamatere2 receptors, mGluRs) 属于G蛋白偶联受体(G p rotein coupled receptor GPCRs) 超家族中家族C的成员。依据其蛋白序列同源性、受体偶联的第二信使系统、以及对不同激动剂的特异性, 已将这些受体分为3 类: Ⅰ组mGluRs 包括mGluR1 和mGluR5; Ⅱ组mGluRs包括mGluR2 和mGluR3;Ⅲ组mGluRs包括mGluR4、mGluR6-8 ......
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