鞭毛银染法的创新探究
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【摘要】本方介绍一种新的鞭毛银染法，对操作者鞭毛染色大有帮助,其染色效果十分理想，完全弥补了原银染色法某些环节上的一些不足。
【关键词】供试菌 鞭毛银染法的创新 制片 菌膜带 脱落
中图分类号：R378文献标识码：B文章编号：1005-0515(2011)3-070-03
本文报告一种新的细菌鞭毛银染色法，通过对二种供试菌染色证实该方法操作简单、快速，重复性好，不仅可得到背景干净，菌体分布均匀，鞭毛清晰可见的染色效果，而且还有延长A、B液的有效使用时间,其效果可作为常规的鞭毛染色方法推广。
1 材料与方法
1.1 供试菌种
铜绿假单孢菌(Psudomonas aeruginosa)，普通变形杆菌(Proteus vulgaris)，由湖南师范大学生命科学学院微生物实验室保存提供。
1.2 培养基
LB培养基配方：胰蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，氯化钠(NaCL)10g，水1000ml，琼脂15g，pH7.4按上述配方成分配好培养基后用试管分装包扎后，经高压灭菌摆斜面冷却凝固,保存在40℃ 冰箱冷藏室24h，使斜面析出冷凝水[1]，为鞭毛染色提供实验材料。
2 方法
2.1 载玻片准备
将新载玻片放入鉻酸洗涤液中煮沸20min，取出用10%氢氧化钠溶液冲洗沥干，然后再放入鉻酸洗涤液中继续煮沸45min，再用蒸溜水清洗干净，保存在95%的乙醇溶液中备用，使用时在火焰上烧去酒精及残留的油迹。鉻酸洗涤液成分及配制法：重鉻酸钾60克，浓流酸460毫升，水300毫升。将重鉻酸钾溶解在温水中，候冷却后，徐徐加入浓流酸配得。此配方对玻片有较强的除油污能力，可提高菌液制片的染色效果。
2.2 菌种活化
为增强细菌个体的活动力，把铜绿假单胞菌和普通变形杆菌原种放入30-32℃的培养箱内连续转管活化五代(24小时/代)[2]。然后把最后一代转接放入32℃培养箱内培养12h作为细菌鞭毛染色的最佳时期。若菌龄超过12h培养，菌体鞭毛容易脱落。培养时间少于10h菌体鞭毛还未完全生长，染色效果不理想。
2.3 染液制备
A液(媒染液)：鞣酸5g，三氯化铁1.5g放入100ml蒸馏水中加热熔解后，加入15%甲醛溶液2ml，%1氢氧化钠1ml[2]，待药液完全混合过滤备用，放置冰箱冷藏室4℃可保存1个月以上，使用时将过滤的溶液内加入1：50双氧水1ml(用无菌水配制)。
B液(染色液)：硝酸银2g，蒸馏水100ml，待硝酸银完全溶解后，取20ml作回滴液，在80ml液中滴加氢氧化铵，当透明的硝酸银液由浑厚褐色液体逐步变为褐色沉淀时，继续滴加氢氧化铵直到溶液中的沉淀刚刚消失变澄清为止，然后滴加回滴液至溶液中出现白雾，轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再继续滴加，当摇动后出现轻微而稳定的薄雾状，停加回滴液，完成配染。如该液密封，避光放置冰箱冷藏室4℃可保存1个月以上。临用前用回滴液滴至雾状出现，方可使用。
2.4 菌悬液孵育
用接种环取斜面底部较湿润的培养物2-3环，移至盛有2ml无菌水试管中微微摇动使菌悬液轻度浑浊，然后把菌悬液试管直立于37℃水浴恒温振荡器中孵育8min，让菌体附着的鞭毛自然舒展游动，有利于提高鞭毛染色的效果。实验表明，细菌孵育3min鞭毛只有部分舒展游动，染色效果欠佳，孵育18min鞭毛和菌体染色明显很大，与真实细菌差异太大，28min后鞭毛从菌体自然脱落，染色效果较差[3]。
2.5 菌液制片
用长滴管吸取少量菌液,在载玻片的一端滴上一滴菌液，把握好载玻片的倾斜度，让菌液从玻片的一端缓慢流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端的多余菌液，利用空气自然干燥。在干燥的制片上显示一条均匀灰白色的菌膜带，有利于A液对鞭毛染色涂片的操作,提高染色涂片的清晰度。
2.6 菌膜染色
取少量A液(媒染液)覆盖在菌膜带上媒染3-4min，用蒸馏水冲洗染液至玻片下端流出无蓝色的清水为止，继续用B液冲去残水，然后滴加大量的B液覆盖涂片染色菌体鞭毛，当涂片菌膜部分出现深褐色时，立即用蒸馏水冲洗，置空气中自然干燥。如在染色过程中,由于气温的关系，若加B液显色较慢,可用木夹夹住染色涂片，用酒精灯文火加热至冒微微热气，当菌膜带出现深褐色时，立即用蒸馏水冲洗，置空气中自然干燥。注意涂片在火焰上加热时，应及时补充蒸发掉的染色液，若菌膜干涸会导致菌体断裂及鞭毛脱落。掌握好火候操作是鞭毛染色成功的重要因素之一。
2.7 油镜观察
本文图片由Motic显微数码互动系统拍摄电脑保存待用。
鞭毛的染色效果与显微镜的好坏有直接关系：鞭毛镜检前用无水酒精和乙醚按7：3的比例混合组成去污剂，把显微镜光学部分檫试干净，可提高鞭毛染色的观察效果。长期使用此去污剂还有保护镜头和延长显微镜寿命的作用。建议原始的二甲苯去污法最好不要继续使用,一对操作者身体有害,二对光学镜头(镜膜)有损伤作用,随着檫试次数的增多，使光学部分越变越模糊,影响菌体鞭毛的观察效果。
3 结果
3.1 染液的用量与温度
A，B液对鞭毛染色成功性很关键，A液染色时用量要少(标准为菌膜带上一层较薄的媒染液)，因为A液作媒染剂主要是加粗鞭毛染色，若用量过大，制片背景会模糊一片。如(图1)，为普通的变形杆菌，由于A、B液染色比较到位，显色效果好，涂片背景干净，菌体深褐色，鞭毛浅褐色，鞭毛形态逼真自然。图片清晰可见。
图1 普通变形杆菌(周生鞭毛)×100
3.2 药液的有效使用期
试验表明，创新后的染液配制方法易学易掌握，鞭毛染色简单，着色率高，还有延长A，B液的有效使用时间。
3.3 营养成分对鞭毛生长的影响
LB培养基含5%酵母提取物和1.5%琼脂凝固剂，提供了大量的维生素及生长因素，使培养基营养更丰富，培养基硬度更适宜，斜面菌苔明显比牛肉膏蛋胨培养基菌苔丰厚得多，更利于铜绿假单胞菌和普通变形杆菌的生长和鞭毛的形成，镜检细菌鞭毛多，粗状，鞭毛染色效果好，着色更容易而均匀。
3.4 菌液孵育
试验表明，常规的菌液孵育改为水浴恒温振荡器孵育，把振荡孵育调速到微微荡动，能够让菌体鞭毛更活跃，鞭毛更舒展。形态更逼真自然。还可缩短鞭毛的孵育时间，达到十分理想的染色效果。
4 讨论
4.1染色与冲洗如(图2)为铜绿假单胞菌，A液媒染时间合适，水洗不够冲充分，背景很脏，伴有很多浅蓝色的颗粒状杂质，使整个菌体鞭毛模糊不清。不利于细菌分类鉴定。
图2铜绿假单胞菌(单端极鞭毛)×100
4.2 玻片清洁与菌液浓度载玻片的清洁和菌液浓度对染色效果十分关键,如玻片上的油污处理不干净，在菌液涂片时，因油迹的关系，使菌滴在载玻片斜面上滚动不易粘膜，形成断断断续续的斑块性菌膜 ,再加上偏高的菌液浓度和斑块性菌膜使菌体堆积成团, 鞭毛交叉粘连，难易分辨，不利于细菌分类鉴定，如(图3)。试验表明：菌悬液孵育浓度以1 ......
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