地塞米松体外诱导子宫内膜癌细胞(HEC-1B)凋亡的研究(1)
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【摘要】目的 探讨地塞米松对体外培养的人子宫内膜癌细胞(HEC-1B)凋亡的诱导作用。方法 选择人子宫内膜癌细胞(HEC-1B)，分空白对照组、阴性对照组、实验组，实验组予不同浓度(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)的地塞米松,阴性对照组为有细胞无药物的培养液，空白对照组中是无细胞无药物的培养液，处理24h、48h、72h后采用MTT测定细胞抑制率，流式细胞仪进行凋亡率的检测。结果 与对照组相比，地塞米松体外作用于HEC-1B细胞24h、48h、72h后， MTT法检测显示细胞增殖抑制，其抑制程度具有时间和浓度的依赖性；流式细胞仪检测结果显示，与阴性对照组相比实验组的细胞凋亡率明显增加(P<0.05)，具有浓度依赖性。结论 地塞米松体外能诱导HEC-1B细胞发生凋亡，对子宫内膜癌细胞具有增殖抑制作用，且这些作用具有明显的剂量效应。
【关键词】子宫内膜癌 细胞凋亡 地塞米松
中图分类号：R737.3 文献标识码：B 文章编号：1005-0515(2011)4-246-02
子宫内膜癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%-30%[1]，多见于老年妇女。目前，化疗已成为晚期癌、复发癌以及具有高危因素的术后患者的主要治疗方法之一，然而子宫内膜癌对化疗并不十分敏感。自上世纪80年代以来，激素治疗成为子宫内膜癌继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗方法，已被应用于临床，并取得一定的疗效[2]。目前国内、外在对细胞凋亡的研究工作中，用糖皮质激素诱导淋巴细胞凋亡已成为研究细胞凋亡的经典模型。地塞米松(dexamethasone， Dex)对肿瘤细胞的增殖抑制作用亦早有研究，Dex可诱导胸腺细胞和恶性淋巴瘤细胞发生典型的细胞凋亡，但其在子宫内膜癌治疗中的作用鲜有报道。本实验旨在研究Dex对子宫内膜癌细胞凋亡的诱导作用，探讨子宫内膜癌发生发展机制，为该药的临床应用提供理论及实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞株来源
HEC-1B细胞为人子宫内膜腺癌细胞株，购自北京细胞中心。
1.1.2 主要试剂及设备
DMEM培养基(Gibico公司)
10%小牛血清(天津血研所)
胰蛋白酶(Sigma公司)
地塞米松(Sigma公司)
MTT试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)
CO2孵箱(TEHER，日本)
流式细胞仪Facscalibun (BD)
全自动酶标仪(SUNRISE公司)
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及处理
人子宫内膜腺癌细胞株(HEC-1B)贴壁培养于含青、链霉素的DMEM培养基中，内有10%小牛血清，置37℃、5% CO2饱和湿度的无菌培养箱中培养，用0.25%胰蛋白酶消化传代，以磷酸盐缓冲液(PBS)进行漂洗，每周传代1-2次，收集细胞，进行分组，实验组分别加入10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L的地塞米松的培养液，阴性对照组加入有细胞无药物的培养液，空白对照组中只加无细胞无药物的培养液。
1.2.2 细胞增殖抑制率的测定(MTT)
收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，培养24h，然后更换培养液。实验组每个浓度设三个平行孔，继续培养48h后，用PBS轻轻洗涤，弃上清。每孔加入100 μl新鲜DMEM培养液，再加入20μl MTT溶液，继续培养4 h 。吸出培养液，加入200μl二甲基亚砜(DMSO)振荡溶解10min，全自动酶标仪上检测吸光度(A)值，测定波长为490nm，空白对照调零。细胞抑制率(%)的计算方法为〔(阴性对照组A值-空白组A值)-(实验组A值-空白组A值)/(阴性对照组A值-空白组A值)〕×100% 。
1.2.3 流式细胞仪检测
将阴性对照组及实验组各个浓度地塞米松处理24h、48h、72h的对数生长期HEC-1B细胞用0.25%胰蛋白酶消化，PBS吹打成单个细胞悬液。离心后用70%乙醇固定过夜。计数细胞，细胞数不少于5×104/ml。加Annexin V/PI染色液，染色20min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.3、 统计学处理
应用SPSS11.0软件进行数据处理，采用方差分析，P<0.05有统计学意义。
2 实验结果
2.1 细胞的生长抑制情况
不同浓度Dex(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6 mol/L)作用后HEC-1B细胞的增殖抑制率如表1。
图1 不同浓度Dex作用后细胞抑制率的变化
由表1和图1中可见，Dex诱导的细胞其生长抑制率呈明显的时间和剂量的依赖性。随着药物浓度的递增，作用时间的延长， 抑制HEC-1B细胞增殖的作用明显增强，各组比较均有统计学意义(P<0.05)。
2.2 HEC-1B细胞凋亡率的变化
流式细胞仪检测结果显示，与阴性对照组相比实验组的细胞凋亡率明显增加(P<0.05),且随浓度的增加而增加，具有浓度的依赖性(P<0.05),但无明显的时间依赖性(P>0.05)。见表2和图2：
表2 流式细胞仪检测到不同浓度的Dex处理后凋亡细胞率(%)
(n=3 x±s)
图2 不同浓度的Dex处理后凋亡细胞率(%)的变化
3 讨论
随着凋亡与肿瘤发生关系的深入研究，已有证据表明细胞凋亡受阻是肿瘤发病的重要机制之一。因此，诱导、促进肿瘤细胞的凋亡可能成为治疗肿瘤重要的策略之一。诱导细胞凋亡的因素很多，其中与治疗相关的因素有化疗药物、放射线、细胞因子、中药等。近年来，随着糖皮质激素(生理性凋亡诱导因子)诱导白血病细胞凋亡成功及临床应用，激素成为肿瘤治疗的新热点[3]。
在人体分泌的糖皮质激素中，最重要的是皮质醇、地塞米松及甲基强的松龙，这些都是基础研究及临床研究中所常用的人工合成的糖皮质激素[4]。本实验分三组进行细胞增殖抑制率的测定，其结果表明，随作用时间的延长，各浓度的增殖抑制作用明显增强，且随浓度增加，抑制率明显增强，每组之间均具有统计学差异(P<0.05)，这表明该药物对HEC-1B细胞的生长抑制作用呈时间和浓度依赖性，结果与国内、外报道基本一致[5]。
本实验通过流式细胞仪检测到细胞凋亡率的变化，结果显示与阴性对照组相比实验组的细胞凋亡率明显增加(P<0.05),具有浓度的依赖性(P<0 ......
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