RhoC在腺样囊性癌中的表达及其与微血管密度的关系
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【摘要】目的 本实验采用免疫组织化学技术，研究RhoC蛋白在腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)中的表达及其与微血管生成之间的关系。探讨RhoC蛋白在腺样囊性癌侵袭转移和血管生成中的作用。方法 选取2007年~2010年间，山西医科大学第一医院口腔颌面外科行手术切除的涎腺肿瘤存档石蜡标本，其中包括涎腺腺样囊性癌30例，良性组织(多形性腺瘤)8例,同期手术切除的正常涎腺组织8例。采用免疫组化二步法检测RhoC及CD34在涎腺正常组织，良性肿瘤，200及腺样囊性癌中的表达及定位，镜下观察染色后的组织，计算微血管密度(microvessel density,MVD)值及RhoC阳性率，并采用SPSS17.0进行数据分析。结果 RhoC蛋白在8例正常涎腺组织中无阳性表达，8例多形性腺瘤组织中有1例呈弱阳性，占12.5%。在30例腺样囊性癌中有24例阳性表达，占80.0%。正常涎腺组织和良性组织组与腺样囊性癌组比较(p<0.01)；腺样囊性癌RhoC阳性表达中MVD值明显高于RhoC阴性表达中的MVD值(p<0.01)。结论 RhoC在腺样囊性癌组织中的表达上调与其血管生成和侵袭转移相关，可能成为判断腺样囊性癌的新指标。
【关键词】腺样囊性癌(ACC) RhoC蛋白 CD34 MVD
中图分类号：R73 文献标识码：B 文章编号：1005-0515(2011)4-039-02
涎腺肿瘤是常见的口腔颌面部肿瘤之一，占人体全部肿瘤的2.3%， 占口腔颌面部肿瘤的22.7%[1] 。恶性肿瘤中粘液表皮样癌、腺样囊性癌、多形性腺瘤恶变和腺泡细胞癌最为常见[2-3]。腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)是口腔颌面外科较常见的涎腺肿瘤，约占涎腺恶性肿瘤的21.9%，发病年龄以30~59岁最多;女性多于男性，男女之比为l:1.7;发生于小涎腺的多于大涎腺，小涎腺多发于愕部，大涎腺多发于腮腺和颌下腺[4]。虽然其一般临床和病理表现的恶性程度较低，但具有侵袭生长和易发生远处转移等独特的生物学行为。这严重影响了其远期疗效和预后。目前对于ACC远处转移发生机制的研究较多，但许多问题尚未阐明，目前临床上仍主要根据ACC的组织病理类型和临床分期对患者进行预后估测，由于肿瘤的异质性等因素，存在较大的不确定。
近年来研究表明，RhoC蛋白的过量表达与肿瘤的侵袭转移密切相关。我们通过分析RhoC在腺样囊性癌组织中的表达及其与微血管密度之间的关系，探讨RhoC蛋白在腺样囊性癌侵袭转移和血管生成中的作用。
1 材料与方法
1.1 病例及标本的选择 选取2007年~2010年间，山西医科大学第一医院口腔颌面外科行手术切除的涎腺肿瘤存档石蜡标本，其中包括涎腺恶性肿瘤腺样囊性癌约30例，良性病变组织8例，除的正常涎腺组织约8例，所有病例均为首发病例，术前均未行任何抗肿瘤治疗。
1.2 主要试剂 羊抗人RhoC多克隆抗体(sc-12116)购自美国Santa Cruz公司，Polink-2 plus山羊超敏二步法免疫组化检测试剂盒(PV-6000-G)，鼠抗CD34单克隆抗体抗体常规免疫组化染色，PV-6000-G通用型二步法检测试剂盒，枸盐酸修复液，胃蛋白酶工作液ZLI-9013(即用型)，浓缩型DAB显色，均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 方法 标本中选取肿瘤边缘部位蜡块，以4μm 厚度连续切片，分别做CD34、RhoC 染色。组织切片后进行烤片、二甲苯脱蜡及一系列降低浓度的酒精水化，3%双氧水封闭内源性过氧化物酶(15 min)，EDTA 修复液微波修复抗原(10 min)用于CD34 染色，胃酶修复抗原(10 min)用于RhoC染色，组织切片滴加鼠抗人CD34单克隆抗体及羊抗人RhoC多克隆抗体后置于37℃烤箱湿盒中孵育(1 h)，取出后滴加辣根过氧化物酶标记的二抗置于37℃烤箱湿盒中继续反应(25 min)，高浓度DAB 显色，蒸馏水中适当终止显色，苏木素复染，常规酒精脱水、二甲苯透明、封片。0.01 mol/L PBS 缓冲液代替一抗作为阴性对照，试剂厂家提供的结肠癌或乳腺癌切片作为阳性对照。
1.4 结果判定 (1)RhoC结果判定：以PBS代替一抗作阴性对照。在油镜下观察随机选择的5个高倍 视野，RhoC免疫组化染色位于细胞质和胞膜，染色强度为黄色、棕黄色或棕褐色。根据瘤组织或非瘤组织中染色程度分为4个等级：缺乏细胞质染色或弱染的评分为“0”未染色；“+”呈黄色；“++”呈棕黄色；“+++”呈棕褐色。其中“0～+”判定为阴性细胞；弥漫的，中到强细胞质染色评分为++～+++，判定为阳性细胞。阳性细胞数≥30%者为阳性，<30%为阴性。(2)MVD 计数：按照Weidner[5]等提出的方法进行计数，首先在低倍视野(×40和×100)下找到肿瘤组织内微血管密度最高的区域即“热区”，这些“热区”多位于肿瘤边缘；然后从中选定三个“热区”，在高倍视野下(×200)计数热区内微血管个数(视野中与邻近微血管、肿瘤细胞及结缔组织清晰分离的棕色内皮细胞或细胞簇，均视为一个独立的微血管；微血管的分支亦作为一个独立的计数单位)，最后结果用均数±标准差(±s)表示。以上均请两位专职病理科医师以双盲法分别进行评估，两者意见不统一时，由两位医师讨论后作出结论。
1.5 实验数据利用SPSS17.0统计分析软件包处理。统计分析方法为x2检验和t检验(方差不齐时采用两独立样本非参数检验Mann-Whitney U检验)，p<0.05表示统计学上有显著差异，p<0.01表示有极显著差异。
2 结果
2.1 RhoC免疫组化染色位于细胞质和胞膜，染色强度为黄色、棕黄色或棕褐色。不同唾液腺组织内有不同程度的RhoC表达，RhoC蛋白在8例正常涎腺组织中无阳性表达，8例多形性腺瘤组织中有1例呈弱阳性，占12.5%。在30例腺样囊性癌中有24例阳性表达，占80.0%。正常肝组织组与另两组比较(p<0.01，表2-1)；RhoC主要表达腺样囊性癌癌细胞胞质和胞膜中，呈棕黄至棕褐色。
表2-1 RhoC在不同涎腺组织中的表达
2.2 CD34标记在组织血管内皮，阳性染色表达局限于血管内皮细胞的胞质和胞膜，呈棕褐色或棕黄色。不同的涎腺组织内的CD34的表达程度不同,在腺样囊性癌中表达明显高于正常涎腺组织和良性组织(t=16.218 ,p<0.01，表2-2)。
表2-2不同涎腺组织中MVD值的差异
2.3 RhoC腺样囊性癌阴性组MVD均值为28.234±10.258；而RhoC腺样囊性癌阳性组MVD均值为46.354±12.354，后者高于前者，差别具有统计学意义(p<0.01)可以看出RhoC的表达与MVD的计数显著相关，即RhoC的过量表达与MVD的表达强度显著正相关(见表1)，这与很多研究结果相符。
表2-3RhoC蛋白的表达和MVD值的关系
3 讨论
综合近年来对RhoC蛋白与肿瘤侵袭转移的研究 ......
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