关于革兰阴性杆菌中质粒ampC基因的检测与分析(1)
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【摘要】目的 运用多重聚合酶链反应(PCR)对革兰阴性杆菌的质粒ampC基因进行检测与分析。方法 选取250株临床分离的革兰阴性杆菌，通过热裂解获取DNA模板，使用六组引物对多重PCR进行扩增，再用琼脂糖凝胶电泳区分PCR产物，记录相关数据，进行统计分析。结果 250株临床分离的革兰阴性杆菌中检测出其中9株为质粒ampC基因阳性。结论 多重PCR技术特异性高，能简单、快速地检测革兰阴性杆菌质粒ampC基因。
【关键词】多重聚合酶链反应 革兰阴性杆菌 质粒ampC基因 检测与分析
中图分类号：R446.5 文献标识码：A 文章编号：1005-0515(2011)7-040-02
On Gram-negative bacteria plasmid ampC gene detection and analysis
ZHOU BiyanLI YouyongSU YongJun WANG Zhangtao
(Guangxi Nanning First People's Hospital, Nanning, Guangxi 530022)
【Abstract】Objective To multiplex polymerase chain reaction (PCR) for Gram-negative bacteria plasmid ampC gene detection and analysis. Methods 250 clinical isolates of Gram-negative bacteria, for DNA template by thermal cracking, the use of six groups of multiplex PCR primers to amplify, and then agarose gel electrophoresis of PCR products to distinguish, record relevant data for statistical analysis. Results 250 clinical isolates of Gram-negative bacteria was detected among 9 of plasmid ampC gene positive. Conclusion The high specificity of multiplex PCR, can be simple, quick detection of Gram-negative bacteria plasmid ampC gene.
【Key words】multiplex polymerase chain reaction Gram-negative bacteria plasmid ampC gene detection and analysis
革兰阴性杆菌的AmpC酶属于BushI型( A mbler C型)β-内酰胺酶，AmpC酶可分为染色体型和质粒介导型。已被报道出来的29种质粒ampC基因编码28种质粒AmpCβ-内酰胺酶，根据不同来源可分为不同的6个群： EBC(源于阴沟杆菌)、CIT(源于弗氏枸橼酸菌)、MoX(来源未知)、FoX(来源未知)、ACC(源于哈夫尼亚菌)、DHA(源于摩根摩根菌)。大多数如肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等质粒ampC基因均被发现于发生院内感染的菌株中[1]。目前，由于产质粒A mpC酶的革兰阴性杆菌对一、二、三代的β-内酰胺类的抗生素均有很强的耐药性，临床上对于产质粒AmpC酶的革兰阴性杆菌引起的感染，治疗效果均不佳，并且很难在临床实验室开展的方法检出质粒介导的AmpCβ-内酰胺酶。本文运用多重聚合酶链反应(PCR)对革兰阴性杆菌的质粒ampC基因进行检测与分析，报道如下：
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取250株临床分离的革兰阴性杆菌，通过热裂解获取DNA模板，使用六组引物对多重PCR进行扩增，再用琼脂糖凝胶电泳区分PCR产物，记录相关数据，进行统计分析。
1.2 检测方法 选取250株临床分离的革兰阴性杆菌临床分离株，以肺炎克雷伯菌M304作为参照，应用电泳仪、电热恒温水浴箱、PCR扩增仪及Eppendorf台式高速离心机进行样品模板制备、多重聚合酶链反应(PCR)基因检测、分析以及对其测序，具体过程如下：
1.2.1 模板制备 将细菌放置在2ml的LB肉汤中进行接种，温度37℃，孵育20小时，取过夜培养物1ml放置Ep-pendorf管中，离心5min，选择13000r/min，上面清液部分舍去，将500μl无菌蒸馏水加进沉淀物中混匀，再置于温度95℃的电热恒温水浴箱中10min，加热细菌裂解后，离心5min，选择13000r/min，细菌残渣去除，取上清液为扩增模板。
1.2.2 PCR过程 将反应液管中的液体，全部转移到耐热酶的试管中。PCR的反应体系为50μl，buffer(游离Mg2+ ) 5μl，Mg 2+3μl，d NTP1μl，MoXMR、MoXMF、CITMR、CITMF、DHAMR、DHAMF0.6μl，ACCMR、ACCMF、EBCMR、EBCMF0.5μl，FOXMR、FOXMF0.4μl，1.25U(0.25μl)的Taq酶和2μl的模板。PCR的反应条件为: 94℃预变性3min，72℃延伸1min，经过35个循环后，61℃退火30s ......
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