广东博罗地区慢性乙肝患者基因型分析
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【摘要】 为了探明广东博罗地区肝炎患者基因型及HBVcccDNA含量水平，利用患者血清为材料，通过利用特异性引物多重PCR方法检测HBV的B，C和D型基因型，同时通过对HBVcccDNA含量进行检测。结果表明，在61例慢性乙型肝炎病毒感染者中，HBV为B型26例(42.62%)、C型4例(6.56%)、BC混合型1例(1.64%)，未能确定基因型31例；HBVcccDNA检测阳性为33例，阳性率为54.09%，无法检测到HBVcccDNA含量的是28例。说明博罗地区HBV基因型以B型和C型多见，BC混合型较少，慢性的乙肝患者的HBVcccDNA含量检测，并不全是阳性的。
【关键词】 肝炎病毒 基因型 基因表达 乙肝病毒共价闭合环状DNA
中图分类号：R512.62 文献标识码：B 文章编号：1005-0515(2011)7-428-02
乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球性的公共卫生问题，在我国危害尤其严重。中国的乙型肝炎病毒感染者中，慢性乙型肝炎(CHB)患者约为3000万人，如不接受正确治疗可进一步发展为肝硬化、肝癌。前人的研究表明HBV基因型与病情轻重有关 [1] [2]，不同的基因型治疗的方式可能所需要的手段也不尽相同。汪莉萍等[3]研究发现，在江苏因徐州地区主要是以C型为主，C型更能引起肝脏的损伤作用，进而发生重型肝炎。肝炎病毒(HBV)是通过DNA自制进行扩增的，其乙肝病毒(HBV)cccDNA的全称是乙肝病毒共价闭合环状DNA，是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始合成模板，是乙肝病毒持续感染的关键因素，对于乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。陈明发和孙水林[4]研究认为CHB患者血清中出现cccDNA是肝脏损害的标志，可以反应病情的轻重及病情的进展，同时也反应了实时荧光定量PCR法检测CHB患者血清HBV cccDNA灵敏性较高、特异性强，可以应用于临床来监测乙肝患者血清中cccDNA的水平及动态变化。HBVcccDNA含量是乙肝病毒复制最特异的指标，其灵敏性和准确性都要超过目前常用的HBVDNA检测。为了进一步探明博罗地区慢性乙型肝炎感染者的基因型及其通过分子生物学来判断它们的病情轻重，我们取患者的血清进行了基因型的检测及cccDNA的定量测定工作，以期为患者的诊治提供指导。
1 材料与方法
1.1 血清标本来源，61例不同临床类型慢性乙型肝炎患者血清来自2010年2月至2011年3月博罗县人民医院感染科住院和门诊HBV感染患者(HBV DNA阳性)。其中男性49 例，女性12 例，平均年龄为49.1±17.1 岁。疾病的诊断依据参照2000年全国肝炎会议拟订的方案[5]。并排除重叠甲、丙、戊型肝炎病毒感染。
1.2 检测方法
1.2.1 HBV基因型检测 实时荧光PCR引物探针设计采用Primer Premier 5软件进行。 HBV-DNA 基因分型检测 应用实时荧光PCR法,应用南方医科大学提供的PCRbuffer和Taq酶,对已知HBV cccDNA检测阳性标本进行基因分型。①取处理液A100μl 于0. 5ml 离心管内,加待测血清100μl ,混匀,13000rpm离心10min,弃上清,加入处理液B25ul,100 ℃煮沸10分钟，13 000rpm 离心10分钟，取上清2μl 于各型基因型反应液管内,弹匀,10 000r/ min 离心10 秒，上机，预变性94 ℃ 2 分钟；循环条件: 94 ℃ 50 秒、55 ℃ 50 秒、72 ℃ 65秒,共循环40次,最后72 ℃延伸3 分钟(阴性、阳性参照同标本处理) 。结果判定按实时荧光PCR的扩增曲线进行判读。哪一型样孔呈阳性结果，则所检病毒基因为该型。
1.2.2 HBV cccDNA定量检测 采用广州华银生物科技有限公司的实时荧光PCR定量检测试剂盒，按照说明进行进行检测。
1.3 统计学处理 采用SPSS10.0软件包，比较B型、C型和B+C混合型HBV DNA水平，先行方差齐性检验，然后进行单因素方差分析并进行两两比较，检验水准α=0.05。
2 结果与分析
2.1 HBV基因型检测结果
从表1的结果可知，在61例慢性乙型肝炎患者中男性49例( 80.33%)，女性12例( 19.67% ) 。HBV基因型检测结果表明，HBV B基因型26例(42.62%)；HBV C基因型4例(6.56)；HBV BC合型1例(1.64%)，在这三种基因型的检测范围内，未能确定基因型的是31例，占50.82%。可见在地区61患者中HBV基因型以B为主，其次C基因型，少量BC混合基因型。
2.2 HBVcccDNA含量型检测结果
从表1我们还可知，在对61份患者血清的HBVcccDN A含量水平的检测表明，从61例患者血清的检测结果表明，HBVcccDNA检测阳性为33例，总患者的阳性率为54.09%，其中B型为24例，它们cccDNA拷贝的对数值为2.00-7.23区间， BC混合的只有一人，其4值为4.09。C为4例，而C型值在3.02-5.33区间，其平均值为3.92；，BC型为1例，平均值为4.32；其他3例。在阳性率中，以B型的最高，然后是C型的阳性率，最低的是未知基因型的。说明在血清内，其他型未确定型的HBVcccDNA含量相对较少。这可能与其病毒的活动能力及复制水平有关。或者与其病情的程度相关。进一步对其拷由数进行对数处理后分析，我们也发现，B型的拷贝数最多，然后是BC型，最后是C型的。
3 讨论
从我们的结果可知，在对三种HBV基因型检测中发现，博罗地区主要是B型基因型为主，这与汪莉萍等[3]研究发现，在江苏因徐州地区主要是以C型为主有不同的，可能是不同的地区，HBV基因型的分布也是有差异。可能与人群的结构和饮食习惯也有差异。
HBVcccDNA 是乙型肝炎( 下称乙肝) 病毒复制的中间体,是病毒RNA 转录的模板。肝细胞内存在cccDNA 是乙肝病毒复制的最直接证据, 也是停药后病毒反弹的最主要的原因。所有慢性乙肝患者肝细胞内都能检测到cccDNA, 外周血中HBVcccDNA 是否存在并不确定。
我们用血清为试验材料，cccDNA检测结果显示61例患者血清细胞中有33例呈阳性结果，阳性率54.09%，这与徐岱等[6]在61例CPH(慢性乙肝)患者标本中发现有32例呈阳性结果，阳性率52.46%的结果是一致的。而其他的乙肝患者的cccDNA则无法检测出来，刘小斌和张伦理[7]的研究表明，在慢性肝炎轻、中、重度患者的HBVcccDNA阳性率分别为32%、52%和76%了有类似的结果，其他CHB患者检测不到可能是与其转录的情况有关。
赵召霞等[8]曾经研究表明，慢性乙型肝炎肝组织炎症轻度患者血清HBV cccDNA 水平低于肝组织炎症中度患者, 说明血清HBV cccDNA 水平越高, 肝组织炎症程度亦相应加重。因为有研究结果说明，CAH患者外周血淋巴细胞中cccDNA拷贝数明显高于CPH患者标本的拷贝数 ......
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