组织工程构建成纤维细胞/PGA真皮替代物的实验研究
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【摘要】目的 通过将真皮成纤维细胞接种PGA(polyglycolicacid)支架材料，观察细胞材料的生物相容性和构建组织工程化真皮的组织形态结构。方法小儿包皮真皮中分离的成纤维细胞，进行传代扩增，观察不同代次细胞体外增殖能力。将成纤维细胞以20million/ml的浓度接种PGA支架材料上。相差显微镜和扫描电镜观察细胞材料粘附情况，H.E.染色对其进行组织形态观察。结果 体外扩增培养的第4代、第5代、第6代细胞具有相同的生长特性。相差显微镜和扫描电镜观察细胞在材料上生长良好，分泌细胞外基质丰富，并随时间进展，细胞逐渐融合，细胞外基质分泌逐渐增多。H.E染色观察成纤维细胞均匀分布于真皮替代物中。结论 真皮成纤维细胞与PGA支架材料细胞相容性好。通过真皮成纤维细胞接种PGA支架材料，能够有效构建组织工程化真皮组织。
【关键词】组织工程 真皮 成纤维细胞 PGA
中图分类号：R318文献标识码：B文章编号：1005-0515(2011)10-054-02
近年来，组织工程学取得了长足发展，显现出其在临床各个领域广阔的应用前景。组织工程化皮肤使大面积烧伤和慢性皮肤溃疡等的治疗方法有了新的选择[1]。组织工程学是一门以细胞生物学和材料学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科 [2]。组织工程种子细胞是否来源广泛和良好的体外扩增能力和组织工程支架材料是否具备生物可降解性和生物可吸收性，是体外构建组织工程化产品的关键因素[3]。本实验中，应用真皮成纤维细胞作为组织工程种子细胞，应用PGA支架材料作为组织工程支架材料，构建成真皮替代物。观察不同代次细胞体外增殖能力。检测种子细胞的生长动力学，对于细胞在支架材料上生长情况及其组织形态进行观察。
1 材料与方法
1.1 主要实验仪器和试剂 扫描电子显微镜(Hitachi，日本)；倒置相差显微镜 (Olympus,日本)；中性蛋白酶(Electrophoresis GmbH公司，德国)；NB4 胶原酶(Electrophoresis GmbH公司，德国)；Hoechst33258(Sigma公司，美国)；蛋白激酶K(Sigma公司，美国)。
1.2 细胞分离、培养和扩增 将儿童包皮环切术术后包皮剪刀剪去皮下脂肪组织，表皮面朝下浸于中性蛋白酶液中， 37℃下消化2～4小时。用眼科镊将表皮与真皮分离开。将分离的真皮组织充分剪碎，加入0.2%NB4胶原酶溶液30ml，在37℃恒温摇床消化3小时。以5×104/cm2细胞密度接种于培养皿内，加入培养液10ml。每3天换一次液，细胞融合至80%即传代。
1.3 细胞生长动力学检测 分别对P4、P5、P6细胞进行生长曲线测定。取对数生长期细胞，消化，制备成单细胞悬液。调整细胞悬液浓度为1×104/ml，接种24孔板，每孔接种1ml，分12组，每组5孔，共60孔。采用Hoechst33258 DNA定量法测定。
1.4 PGA支架材料制作和细胞接种材料 取无纺PGA纤维20mg，制造成10×10mm2大小，8mm厚度。PGA支架常规75%酒精、紫外线消毒，培养液洗涤两次后洗干，加入20million/ml 的成纤维细胞悬液，使细胞悬液均匀浸满于生物支架材料上，转移至10cm培养皿中。于倒置相差显微镜在接种后第7天观察细胞材料复合物。
1.5 扫描电镜观察 取20mg、10×10mm2大小、8mm厚度的PGA材料接种细胞密度为20million/ml 的含成纤维细胞DMEM悬液，接种液体量为130μl。细胞材料复合物在高糖DMEM培养液中培养，于培养第3周取材。扫描电镜观察、照相。
1.6 H.E染色观察 取20mg、10×10mm2大小、8mm厚度的PGA支架材料接种20million/ml 的成纤维细胞悬液，接种液体量为130μl。DMEM培养液中培养，于第3周取材，5%多聚甲醛固定，石蜡包埋，H.E染色。
2 结果
2.1 成纤维细胞生长动力学检测 将P4、P5、P6计数结果分别绘制生长曲线，可见第4代、第5代、第6代细胞在接种后第1天到第4天为快速增殖期，第5天至第7天为平台期，第8天略有下降。第4代、第5代、第6代细胞生长曲线相似，具有相同的生长特性。见图1。
2.2 倒置相差显微镜观察细胞材料复合物在培养液中生长，可见支架材料边缘处可见多个细胞及其分泌的细胞外基质连成一片，PGA材料埋于其中，细胞与支架粘附良好。见图2。
2.3 扫描电镜观察 细胞材料复合物在培养液中培养，可见细胞材料粘附良好，细胞分泌细胞外基质丰富，2周时基本细胞外基质覆盖材料空隙，PGA支架材料出现降解，3周时细胞外基质完全覆盖PGA支架材料。见图3。
2.4 H.E染色观察 细胞材料复合物在培养液中培养，3W后取出做H.E染色观察，可见成纤维细胞均匀分布在PGA支架材料上。见图4。
附图：
图1
图2
图3
图4
图1：第4代、第5代、第6代成纤维细胞生长曲线的测定。
图2：倒置相差显微镜观察细胞材料复合物，细胞与材料粘附良好，PGA纤维被包埋其中。
图3 扫描电镜观察细胞材料复合物。
图4：细胞材料复合物H.E.切片染色，可见成纤维细胞分布于PGA支架材料之中。
3 讨论
真皮成纤维细胞来源广泛，在体外扩增能力强，传代多次仍保持活力，对于构建组织工程化真皮来说是一个很好的种子细胞[4]。本实验中对儿童包皮环切术术后取的包皮进行收集成纤维细胞。我们选用传代至第4代至第6代成纤维细胞作为接种的种子细胞。通过实验研究，我们发现，第4代至第6代成纤维细胞细胞增殖没有明显差异。因此我们认为第4代至第6代成纤维细胞构建组织工程化真皮不存在明显差异。
细胞与支架材料之间的相互作用是组织工程研究的重要领域之一。细胞与材料的粘附是基础，细胞必须与材料发生适当的粘附才能进行迁移、分化和增殖[5]。我们通过相差显微镜和扫描电镜下检测观察均显示成纤维细胞与材料具有良好的相容性。相差显微镜下观察，成纤维细胞在PGA支架材料空隙中生长，并同时分泌丰富的细胞外基质，随着时间增加细胞外基质而逐渐增加。在扫描电镜下观察则同样证实了这一点。第三周细胞和细胞外基质完全覆盖PGA支架材料。对构建真皮替代物行H.E切片染色观察，可观察成纤维细胞均匀分布在真皮替代物中。
本部分实验表明，通过应用真皮成纤维细胞作为种子细胞，应用PGA材料作为支架材料，将成纤维细胞接种于PGA支架材料，PGA支架材料具有良好的生物相容性，成纤维细胞能够与PGA支架材料具有良好的粘附。成纤维细胞在PGA支架材料上生长良好，随时间生长分泌细胞外基质逐渐增加，有效构建组织工程化真皮组织。
参考文献
[1] Dini V, Romanelli M, Piaggesi A, Stefani A, Mosca F ......
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