阿司匹林对肠上皮细胞株Caco-2凋亡的影响(2)
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养和阿司匹林处理：将Caco-2细胞置于细胞培养瓶内,以DMEM高糖培养液为培养液。在37℃、50 mL/L CO2培养箱中进行培养，隔天更换培养液，每3 d按1:3比例传代，实验时取对数生长期细胞。本实验分为四组，即对照组(加细胞不加药物组)，5mmol/L 、10mmol/L和20mmol/L阿司匹林作用组。将Caco-2细胞接种于6孔板或96孔板后，按照各实验要求取样。
1.2.2 阿司匹林对Caco-2细胞生长抑制的作用：收集对数期细胞制成细胞混悬液，以每孔2×104加入96孔培养板中，每孔体积200 μL。37℃，50 mL/L CO2的培养箱中培养24 h后换上含不同浓度阿司匹林的培养液(5mmol/L，10 mmol/L，20mmol/L)180μL，每种浓度设6孔重复，以不含阿司匹林的培养液180μL为阴性对照分别培养24 h及48 h，每孔加入MTT20μL，温浴4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，室温避光摇床上充分振荡20min，混匀后以空白孔调零，在酶标仪上检测490nm波长吸光度值(A )。按下列公式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。经换算成细胞存活率。
1.2.3 倒置相差显微镜观察细胞形态：取对数期Caco-2细胞制成细胞混悬液接种于6孔板，培养箱中培养24 h贴壁后，将含不同浓度阿司匹林(浓度分别为0，5，10和20mmol/L)的培养液与细胞共同培养24h后，在倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化。
1.2.4 流式细胞术Annexin V FITC/PI双染法检测药物对Caco-2细胞凋亡的影响：将阿司匹林与对数生长期的Caco-2细胞作用24 h后，0.25%胰酶消化，2000 r/min离心5 min, 弃去上清及细胞碎片, 收集细胞悬液; 冷PBS液洗涤两遍, 调整细胞浓度至1×109 cell/L; 加入Annexin V-FITC和PI各5μL; 旋涡混匀, 避光室温孵育15 min后立即用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.3 统计学方法 实验数据用x±s表示, 两组间比较采用成组设计t检验；SPSS15.0软件进行数据处理及分析，P<0.05认为差别有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度阿司匹林对Caco-2细胞生长的影响
加入阿司匹林24h后，从培养箱中取出6孔板，在倒置相差显微镜下观察。对照组及5 mmol/L组细胞生长良好，未见明显死亡细胞。10 mmol/L组，细胞变圆变小，少量细胞脱落漂浮于培养液中。20 mmol/L组，则可见大部分细胞都脱离贴壁状态而漂浮起来，部分细胞核浓缩，有许多细胞成为碎片，只有少数细胞仍留在底部。细胞损害随药物浓度增加而增大。
2.2 不同浓度阿司匹林作用于Caco-2细胞不同时间，细胞存活率的变化
随着阿司匹林作用浓度的增加及作用时间的延长，Caco-2细胞的生长抑制率逐渐升高，即细胞存活率越来越低，且这种作用呈现剂量-时间依赖性(表1, P<0.05)。
表1 各浓度组阿司匹林作用于Caco-2细胞后的细胞存活率
(n=6,mean±SD)
注：与对照组相比，P▽ <0.05；与24h组相比P▲<0.05；与48h组相比P■<0.05；与阿司匹林1组相比，P＃<0.05；与阿司匹林2组相比，P△<0.05；与阿司匹林3组相比，P<0.05。
2.3 不同浓度阿司匹林对细胞凋亡的作用(Annexin V FITC/PI双染法)
正常活细胞Annexin V及PI均低染(Annexin V-PI-)，分布在流式细胞分析图的左下区；凋亡早期细胞Annexin V高染而PI低染(Annexin V+PI-)，分布在图的左上区；凋亡晚期细胞或死亡细胞Annexin V及PI均高染(Annexin V+PI+), 分布在图的右上区。流式细胞术显示：对照组凋亡率为3.8%(早期凋亡率为2.6%，晚期凋亡率为1.2%)；5mmol/L阿司匹林组凋亡率为12.7%(早期凋亡率为6.8%，晚期凋亡率为5.7%)；10mmol/L阿司匹林组凋亡率为44.7%(早期凋亡率为30.8%，晚期凋亡率为13.9%)；20mmol/L阿司匹林组凋亡率为58.1%(早期凋亡率为34.6%，晚期凋亡率为23.5%)。随着药物浓度增加，Caco-2细胞凋亡率亦随之增加。
图1 Annexin V FITC/PI双染法检测不同浓度阿司匹林与Caco-2细胞作用24h后细胞的凋亡情况。 A: 对照组; B: 5mmol/L组; C: 10mmol/L组; D:20mmol/L组。
3 讨论
近年来，越来越多的研究[4-6]表明非甾体类抗炎药不仅可以引起胃的损伤，而且可以引起肠道副作用。但是阿司匹林对肠道的不良反应则研究较少[7]。目前研究认为，阿司匹林引起肠道损伤的可能原因主要有以下几点：⑴ 阿司匹林与膜磷脂作用从而直接损伤肠上皮细胞，并且使氧化磷酸化解偶联而损伤线粒体。线粒体的损伤导致细胞内能量缺失，钙离子外流以及大量氧自由基的产生。⑵ 阿司匹林选择性抑制COX，减少了内源性前列腺素的合成与释放，破坏肠上皮黏膜的屏障作用，引起肠内细菌及侵袭因子的侵入，从而诱发新的炎性病灶的产生，诱发旧的溃疡病灶复发[8]。⑶ 阿司匹林对肠黏膜有直接的化学刺激作用，而且由于药物的肠肝循环特点，从而延长了其与结肠黏膜的接触时间。肠腔内容物如细菌、胆盐、食物等可以进一步诱导损伤，其中细菌可能是主要的侵袭因素。
Caco-2细胞来源于人结肠腺癌细胞株，在培养条件下可以自发形成有极性、具有微绒毛以及紧密连接类似小肠细胞刷状缘侧的分化特征的致密的单细胞层组织，其形态与人体的肠上皮细胞相似[9]。由于Caco-2细胞可以分泌与人体相同的酶类及转化因子等[10]，并且与被动吸收的营养物质有较好的相关性，故也广泛用于药物的吸收、分配、代谢、排除及毒性研究。
本项研究利用MTT比色方法了解阿司匹林对Caco-2细胞的剂量及时间毒性情况。阿司匹林在实验给定浓度(5、10和20mmol/L)的条件下，对Caco-2细胞的增殖和细胞活力有显著的抑制作用，并且，这种作用呈现剂量-时间依赖性 ......
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