双酚与氯化镉对乳腺癌细胞MCF-7增殖作用的研究(2)
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参见附件(3291KB，3页)。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞
人乳腺癌细胞MCF-7，购自于武汉博士德公司。
1.1.2 药品与试剂
双酚A(BPA)、氯化镉(CdCl2)、17β-雌二醇(estradiol,E2)、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)；DMEM高糖培养基及胰酶购于HyClone公司；胎牛血清FCS购于杭州四季青生物工程公司。
1.1.3 实验仪器
超净工作台(日本AirTech公司)、酶标仪(美国宝特公司，ELX-800型)、CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与传代
MCF-7细胞在含10%胎牛血清DMEM高糖培养基中，饱和湿度、温度37℃、5%CO2条件下培养。用不含EDTA的0.25%胰酶消化、传代。
1.2.2 细胞染毒
在实验前，用PBS缓冲液冲洗细胞后，以不含酚红的DMEM培养基(5%去激素血清)在37℃、5%CO2、饱和湿度下培养3天，使其耗尽细胞内残余的内源性雌激素。然后将处理后的细胞制备成2×104/mL的细胞悬液，按100uL/孔细胞悬液接种于96孔培养板，24h贴壁后吸去培养液，并用无血清的培养基洗涤细胞一遍，每孔加入100 uL含一定浓度受试物的培养液，设立溶剂对照组，溶剂对照组添加等体积的无水乙醇；以雌二醇(E2)为阳性对照，每个浓度组及对照组均设4个复孔，染毒后于37℃、5%CO2、饱和湿度，置CO2培养箱中培养24小时后，加入MTT溶液50微升，继续培养4h，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150微升，在微量振荡器上震荡10min，待紫色蓝色沉淀充分溶解，于酶标仪490nm波长处测定吸光度(OD值)，计算实验组与溶剂对照组的OD490的比值即为细胞相对增殖效应(以增殖效应作为评价标准)。
1.2.3 不同实验类别中各毒物的剂量范围见表1：
表1 实验类别及E2、BPA、CdCL2浓度
1.2.4 统计学方法
数据采用SPSS16.0进行统计学分析，各剂量组间OD值均数比较采用方差分析。联合作用评价采用方差分析，并用边际均数轮廓图法显示交互作用。
2 结果
2.1 E2单独作用的剂量效应关系
从图1中可见，E2单独剂量效应曲线可分为2段：平台期(1.0×10-10~1.0×10-6 mol/L)作用最大并保持稳定；下降期(1.0×10-6~1.0×10-3 mol/L)增殖效应随浓度的增加而下降，在浓度为1.0×10-4mol/L时反而对细胞生长出现抑制作用，其相对增殖效应降为0.305,在1.0×10-3 mol/L时达到最低。
图1 E2单独作用剂量--效应图
2.2 BPA单独作用的剂量效应关系
由“BPA单独作用的剂量效应图”中(图2)可见，BPA从低浓度开始逐渐发挥其雌激素效应促进细胞增殖，在1.0×10-6 mol/L时达到最大，其相对增殖效应为2.091(P<0.05)，而随着浓度的逐渐增加，其毒性取代了增殖效果，从而产生细胞毒性，到1.0×10-3 mol/L时细胞存活率降至最低。
2.3 氯化镉单独作用的剂量效应关系
图3为氯化镉的剂量效应曲线图，从图中可以看出，氯化镉在浓度1.0×10-8mol/L开始发挥了拟雌激素效应，出现促进细胞增殖的作用,随剂量的增加呈上升趋势,并在1.0×10-6mol/L时其增殖效应达到最大，其相对增殖效应为1.3528(P<0.05),其后随其浓度的增加而下降，在1.0×10-4mol/L时开始抑制细胞生长，至1.0×10-3 mol/L时细胞增殖效应达到最低。
图2 BPA、氯化镉单独作用剂量--效应图
2.4 BPA+金属镉联合作用的剂量效应关系
如图4所示，当BPA和氯化镉在1.0×10-5、1.0×10-6或1.0×10-7mol/L浓度下，单独作用于MCF-7细胞时，其相对增殖效应均高于二者联合作用时的情况，显示二者在联合染毒时对细胞的增殖具有拮抗作用的趋势。
图4 联合作用相对增殖率曲线图
注：与溶剂对照组相比*P<0.01，** P<0.05；
2.5 边际均数轮廓图
从“边际均数轮廓图”中(图5)可以看出，当BPA与氯化镉均为1.0×10-5、1.0×10-6或1.0×10-7mol/L浓度时，两条线段均呈相交状态，交互项同时具有显著统计学意义(P<0.01)。如果交互作用不显著，两条量效曲线互相平行，说明两因素间存在相加作用；如果两曲线随产剂量增大而远离则两因素间存在协同作用。反之，如果两曲线随剂量增大而靠近或交叉，则具有拮抗作用。边际均数轮廓图显示BPA和氯化镉在这三个浓度的联合作用时均表现为拮抗作用。
图5 BPA与氯化镉联合作用边际均数轮廓图
3 讨论
近年来妇女乳腺癌发病率逐渐增加，环境雌激素是重要的影响因素之一。人乳腺癌细胞MCF-7是如今最常用的检测雌激素样活性的细胞株，最早是从雌激素依赖的转移性乳腺癌分离并建株。MCF-7细胞里包含有丰富的雌激素受体，在雌激素的作用下能对细胞产生增殖，而且其对雌激素样物质反应相当灵敏，对非雌激素样化学物其效果微弱甚至无反应[10]。在研究环境内分泌干扰物[9](EDCS)通过雌激素模拟途径促进细胞增殖方面，应用最为广泛。而随着工业生产日益发展，大量的化学污染物质进入环境中，其中部分在环境中不难以降解，当几种环境污染物共存时，对生态系统、对人体就会发生复杂的联合毒性作用。因此使得研究联合毒性作用成为研究的热点。目前国内外对于环境污染物联合作用的评价方法尚未形成统一的体系，2×2析因分析不仅可检验每个因素各水平间的差异，而且可检验各因素间的交互作用，并且不需要依赖化合物各自的LD50和EC50即可进行评价。本文者采用更加直观的剂量-效应直线图描写毒物联合毒性作用的方式，如图中2条量效曲线互相平行，则说明二因素之间具有相加作用；如二曲线随剂量增大而远离，二因素之间具有协同作用。反之，如二曲线随着剂量增大而靠近或交叉，二因素之间具有拮抗作用[6-7]。李宏等研究结果显示，雌二醇能在一定程度上增强镉对MCF-7细胞的增殖[7]。在本研究实验中，BPA和氯化镉单独作用的实验结果显示，双酚A、氯化镉在一定浓度上和雌二醇相似，通过雌激素受体途径对MCF-7细胞促增殖效应，其细胞增殖效应均高于溶剂对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明BPA和氯化镉均具有明显的拟雌激素活性，均能促进细胞增殖。在BPA和氯化镉对人乳腺癌细胞MCF-7联合作用的实验中，当BPA和氯化镉的浓度均为1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7mol/L时他们联合作用边际均数轮廓图中的两条线段均交叉，呈现出拮抗作用的趋势，因此BPA和氯化镉共同作用于MCF-7细胞时，二者联合作用的方式为拮抗作用。国内研究报道多认为有E2存在时，环境雌激素的效应及作用会得到进一步的增强 ......
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