来氟米特对实验性IgA肾病肾组织中MIF和COX-2表达的影响
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2010年12月1日
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[摘要]目的探讨来氟米特对实验性IgA肾病肾组织中MIF和COX一2表达的影响。方法 采用LPS+BSA+CCL造模，采用免疫组织化学的方法，镜下观察空白组，模型组和治疗组MIF和COX一2的表达情况。结果 来氟米特激降低了实验性IgA肾病大鼠尿中蛋白含量，血清肌酐和尿素氮的含量。同时也抑制了IgA肾病大鼠肾组织中MIF和COX一2的表达。结论 来氟米特通过抑制IgA肾病肾组织中MIF和CoX-2的表达，从而抑制了IgA肾病的炎症和免疫反应，减轻了对肾小球的破环。
[关键词]来氟米特； IgA肾病； 大鼠模型； MIF和COX-2
[中图分类号] R318.16[文献标识码]A [文章编号] 1005-0515(2010)-12-182-01
在我国，IgA肾病是一种慢性肾小球肾炎最常见的病理类型，是以肾小球系膜区IgA免疫复合物沉积为特征的一类肾小球肾炎，其病理变化是以系膜增殖为主要表现的基本组织学改变，临床表现以血尿为主要，是终末期肾衰最常见病因之一，到目前为止，其发病机制仍未得到完全阐明[1]。现代研究表明，巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是一种来源于T淋巴细胞的细胞因子，在免疫介导肾脏疾病中起着重要作用。环氧化酶一2(CoX一2)是前列腺素合成的限速酶，COX一2作为诱导酶参与炎症、多种肾脏疾病的发生发展过程[2]。并且MIF和CoX-2在实验性IgA肾病肾组织的表达与肾组织损伤的程度呈正相关。本次实验的目的旨在观察来氟米特(Leflunomide,LEF)对实验性IgA肾病中的影响。
1材料
1.1动物健康SD雄性大鼠36只，清洁级，体重180±10g。
1.2药品和试剂来氟米特(Leflunomide,LEF)(美国欣凯公司生产)。牛血清白蛋白(BSA)和脂多糖(LPS，美国Sigma公司)
2 方法
2.1造模及给药把小鼠随机分为3组：空白对照组，模型组和治疗组。除空白对照组外，其余两组进行造模。除正常对照组外，其余各组运用脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)+四氯化碳(carbontetrachloride，CCL4)+牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)联合造模：BSA(400mg/kg，隔日灌胃)×6周+LPS(0.05rag/次/只，第6，8周尾静脉注射各1次)+蓖麻油(O.5ml/次/只+CCL40.10ml/次/只，皮下注射/周)×9周[3]。来氟米特组从第8周开始用药，共用4周，剂量分别如下：来氟米特组25mg/kg·d灌胃给药。空白对照组和模型组灌服等容积蒸馏水。
2.2 检测方法
2.1 指标的检测定期收集动物尿液监测尿蛋白含量，红细胞，眼睛采血检测血清肌酐和尿素氮值。
2.2 取材和组织处理造模给药后12周末动物处死取血；4℃离心，取血清-20℃保存待用；双侧肾脏取材，采用冰冻切片IgA免疫荧光染色和石蜡包埋，常规切片5μm，苏木素-伊红(HE)染色，镜下观察肾小球系膜增生程度及淋巴细胞浸润的变化；采用2.5%戊二醛固定组织，电镜下观察系膜区是否有免疫复合物沉积及肾小球细胞超微结构变化。
2.3 MIF和CoX一2的测定两者均采用免疫组织化学SP法(具体方法按说明书才做进行)。
2.4镜下评分标准每张切片随机观察，根据阳性细胞占同类细胞总数的百分率及细胞染色强度综合判定。基本不着色为0分，着色淡者为1分，着色适中者为2分，着色深者为3分；着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分，6%～25%为1分，26～50为2分，>50%为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分之和作为最后得分，O～1分为阴性(-)，2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)[4]。
2.5 统计方法软件用SPSS15.0，计分的评价统计方法采用非参数检验(Kruskal–Wallistest)，其余用多因素方差分析。
3 结果
3.1来氟米特对实验性大鼠IgA肾病蛋白含量，血清肌酐和尿素氮的影响见表一。
3.2 来氟米特对实验性大鼠IgA肾病MIF和CoX-2表达的影响见表二。
表二来氟米特对实验性大鼠IgA肾病MIF
和CoX-2表达的影响
4 讨论
本实验联合应用LPS+BSA+CCL造模[1]，模型组大鼠肾脏病理组织镜下可观察到模型组肾小球数轻度增加，系膜区明显增宽，系膜细胞和系膜基质中、重度增生间质血管充血、水肿。免疫荧光检测显示模型组大部动物肾小球内可见IgA复合物沉积，与文献报道相一致[2]。
来氟米特是一种新型的免疫抑制剂，其主要通过抑制嘧啶合成使BT淋巴细胞的增值都停止在G1期，从而抑制了淋巴细胞介导的细胞和体液免疫反应、减少抗体和淋巴因子的合成与分泌[5]。此外，他还是一种有效的各种炎症刺激诱导的NF-KB激活的抑制剂，可抑制炎症和免疫活性，通过抑制Th1效应细胞的活化剂调节Th1向Th2淋巴细胞分化而产生对T淋巴细胞增生的抑制作用。从而很明显的减轻肾小球肾炎的病理表现[6]。MIF是含有115个氨基酸的蛋白质，分子量12.5KD，具有由a链和β链组成的三维结构。MIF与炎症和免疫反应有关，在细胞生长和分化中起重要作用。环氧化酶是花生四烯酸转化为前列腺素过程中的限速酶，它的两个同工酶CoX-1和CoX-2的基因结构不同，CoX-1在许多组织中表达并且在组织稳态中起作用。而在多数细胞和组织中CoX-2是诱导型，但在细胞受到各种刺激，如炎症介质、生长因子、细胞因子、促癌剂等的诱导下迅速合成，参与炎症过程[7]。
本实验研究发现，来氟米特治疗组有效的降低了实验性大鼠IgA肾病尿蛋白，血清肌酐和尿素氮的含量，对于IgA肾病中MIF和CoX-2表达起到了明显的抑制作用。说明来氟米特对IgA肾病的治疗可能是通过抑制MIF和CoX-2的表达，从而抑制了IgA肾病的炎症和免疫反应，减轻了对肾小球的破环。
参考文献
[1] 叶任高.内科学[M].北京：人民卫生出版社,2000 ......
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