锡(Ⅳ)-邻苯二酚紫-蛋白质-OP显色体系光度测定蛋白质的探讨
 |
| 第1页 |
参见附件(2168KB，2页)。
[摘要] 本文对锡(Ⅳ)-邻苯二酚紫-蛋白质-OP显色体系进行了研究，建立了一种简便、灵敏、快捷快速测定尿液微量蛋白的新方法--锡(Ⅳ)-邻苯二酚紫-蛋白质-OP显色光度法，该法蛋白质含量在0~150ug/5.0ml范围内符合比尔定律，方法应用于尿液总蛋白测定结果令人满意。
[关键词] 锡(Ⅳ)-邻苯二酚紫-蛋白质; 分光光度法
[中图分类号] R113[文献标识码] A[文章编号] 1005-0515(2011)-03-001-01
[Abstract] In this paper，a simple sensitive and precies method for determination of total protein in urine by spectrophotometry with Sn(Ⅳ)-PV- Protein-OP Colour System was established.Beer's law is obeyed in the range of 0~150.0ug/5.0 ml of total protein，the proposed method has been applied to determine total protein with satisfactory results.
[Keywords]Sn(Ⅳ)； Pyrocatechol Violet； Protein； Spectrophotometry
金属离子-金属指示剂-蛋白质-表面活性剂显色体系光度测定蛋白质是近十多年发展起来的一类新方法，这类方法一般灵敏度较高选择性良好，为蛋白质的定量分析提供了一个新的途径。已报道的主要有Ti-4，5二溴苯基荧光酮-Tween-80体系[1]、Mo(Ⅵ)-邻苯二酚紫(PV)- 乳化剂OP(OP)体系[2]、Mo(Ⅵ)-邻苯三酚红络合体系、Mo(Ⅵ)-水杨基荧光酮-OP体系[3]、Zn(Ⅱ)-溴邻苯三酚红体系[4]等，但Sn(Ⅳ)- PV-OP体系未见报道，我们在试验中发现，在弱酸性介质中，蛋白质与Sn(Ⅳ)- PV-OP体系发生显色反应生成一种兰色配合物，其最大吸收波长(λmax)位于655nm，且体系的吸光度与蛋白质含量在一定的范围内具有良好的线性关系，在此基础上，我们提出了尚未见报道的Sn(Ⅳ)-PV-蛋白质-OP显色体系光度测定蛋白质的新方法，其线性范围为0-150ug/5.0ml，最低检出浓度为5.0mg/L，方法应用于尿液微量总蛋白的测定，其结果与考马斯亮兰G-250(CBB-G250)光度法相吻合，加标回收率在94-105%，相对标准偏差(RSD)在1.6-4.7%(n=5)，方法的灵敏度和选择性也令人满意。
1实验部分
1.1 主要仪器及试剂
7520紫外/可见分光光度计(上海分析仪器厂)，721分光光度计(四川分析仪器厂)；总蛋白标准液(北京精细化工厂)：70.0mg/ml，临用时稀释至250ug/ml；乳化剂OP溶液：5%(V/V)；邻苯二酚紫(PV)溶液：1.3mmol/L；Sn(Ⅳ)标准液(1.0 mg/ml)：称取金属锡(99.9%)0.1000g于100 ml烧杯中，加10 ml浓硫酸盖上表面皿加热至溶解，取下表面皿继续加热至冒浓白烟，冷却后缓缓加入50ml纯水，用10%的硫酸溶液转移定容至100ml(此液H+浓度经容量法测定为4.80mol/L)；混合显色液(临用时配制)：取Sn(Ⅳ)标准液3.0 ml加入PV溶液10 ml混合后用纯水稀释至50ml；NaAC溶液：0.30 mol/L；尿液空白液：按文献[5]的量配制，称取1.8gNaCl、0.74gNa2HPO4.12H2O、0.30gNa2SO4和NH4Cl、2.0g尿素、0.14g肌酐溶于100 ml纯水中。
1.2实验方法
1.2.1 标准曲线的绘制 取总蛋白标准液0、25.0、50.0、75.0、100.0、125.0、150.0 ug于10ml比色管中加纯水至2.0 ml，加入OP溶液及混合显色液各1.0ml混匀，加入NaAC溶液1.0ml混匀，放置15～20min，于655 nm用1cm比色皿以试剂空白作参比测量各管吸光度(A)，绘制工作曲线。
1.2.2 尿样测定 取澄清新鲜尿样(尿蛋白定性呈“+”以上)及尿液空白液各50-100ul(尿样蛋白含量<150 ug)于10ml比色管中，以下按1.2.1操作并以尿液空白对照液为参比测量A，以工作曲线法进行蛋白质定量。
2 结果与讨论
2.1 吸收光谱
Sn(Ⅳ)- PV-OP体系和Sn(Ⅳ)-PV-蛋白质-OP体系的λmax分别位于565nm和655 nm，Δλ=90 nm(见图1)。
Fig.1Absorption spectra
1.Reagent blank vs. H2O
2. Sn(Ⅳ)-PV-Protein-OP vs. H2O
3. Sn(Ⅳ)-PV-Protein-OP vs. reagent blank
2.2 酸度的影响及NaAC溶液的用量
试验表明，蛋白质与Sn(Ⅳ)- PV-OP体系在弱酸性介质中可发生显色反应，且pH在1.4-4.0体系有最大且稳定的吸光度，本法在pH≈3.0醋酸盐缓冲介质中进行试验，本法使用的Sn(Ⅳ)标准液中[H+]为4.80mol/L，试验时在体系中加入0.06ml时，体系的[H+]为0.0576mol/L，同时在此体系中加入0.30 mol/LNaAC溶液1.0 ml时，体系的pH值刚好为3.0左右，且NaAC溶液的用量在0.80-1.20时体系有最大且且稳定的吸光度，故选用1.0ml。
2.3 Sn(Ⅳ)及PV溶液用量
Sn(Ⅳ)标准液用量在0.05～0.12ml，PV溶液用量在0.15～0.25ml时体系有最大且稳定的吸光度，但随着Sn(Ⅳ)及PV溶液用量的增大，空白管呈色加深，为使空白管呈色适宜，我们分别选用0.06ml和0.20ml。
2.4 OP的影响及用量
试验发现，蛋白质与Sn(Ⅳ)- PV-OP体系生成的兰色配合物难溶于水而沉于管底 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2168KB，2页)。