济宁地区CYP17基因多态性与多囊卵巢综合征相关性研究(2)
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1.3 主要仪器及试剂 Taq DNA聚合酶，dNTP，50 bp DNA、100bp DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司，限制性内切酶MspA1I购自美国Promega(普洛麦格)公司, 引物由上海博亚生物技术工程有限公司合成。PCR扩增仪由德国Eppendorf(艾本得)公司生产。
1.4 方法
1.4.1 DNA抽提 于月经第2-3天或闭经患者任何时期，抽取外周静脉血5ml，取500μl全血，用EDTA抗凝，用DNA提取试剂盒按药盒说明进行操作，无水乙醇沉淀，提取基因组DNA，自然干燥后-20℃保存备用。
1.4.2 内分泌指标检测 所有参与者均在月经周期的第1-3天抽取肘静脉血，用化学发光法测定卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)水平。
1.4.3 引物设计 参照文献[6]报道的序列设计引物。引物1：5’-CATTCGCACTCTGGAGTC-3’,引物2：5’-AGGCTCTTGGGGTACTTG -3’, 扩增CYP17基因含-34bp多态位点的一段DNA，片段大小为419bp。
1.4.4 PCR反应 反应体系25μl，含基因组DNA0.7μl，25mmol/L Mgcl21.5μl，2.5 mmol/L dNTPs 2μl, 50pmol/μl引物各0.25μl,Taq DNA聚合酶(5U/μl)1.5μl。循环条件：94℃，预变性5min, 94℃ 1min, 66.2℃1min, 72℃1min, 35个循环；最后72℃延伸10min。
1.4.5 电泳分离DNA片断 先经10g/L琼脂糖凝胶电泳显示扩增效果, 然后以限制性内切酶MspA1I酶切 PCR扩增物，取酶切产物于3%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色，紫外投射反射仪下观察、摄像并保存，50bpDNA Marker作参照。CYP17基因-34bp处T→C的碱基置换后产生一个MspA1I酶的酶切位点，因此MspA1I酶切扩增产物后，正常无碱基置换者(A1A1)无酶切位点，仍为419bp；T→C碱基置换纯合子(A2A2)含一个酶切位点形成295bp和124bp 2个片段；杂合子(A1A2)形成419 bp、295bp和124bp 3个片段。
1.5 统计学处理 SPSS13.0软件包进行统计分析，用方差分析t检验比较组间性激素水平、BMI、年龄等，x2检验比较基因突变率、基因型频率和等位基因频率。检验水准：a=0.05。
2 结果
2.1 PCOS组与对照组年龄、BMI、和基础性激素水平比较 PCOS组T、LH、LH/FSH均显著高于对照组(P<0.01)。两组间FSH、PRL、E2和BMI差异无统计学意义，PCOS组较对照组稍年轻，两组之间年龄无统计学差异(P>0.05)，见表1
表1PCOS与对照组年龄、BMI和性激素比较(X±S)
2.2 CYP17基因经MspA1 I酶切后的基因型和等位基因频率分布 CYP17基因型A1A1、A1A2和A2A2频率分布在PCOS组与对照组间无统计学差异(P>0.05)。A1、A2等位基因频率分布PCOS组与对照组间无统计学差异(P>0.05)，见表2
表2PCOS组与对照组CYP17基因型和等位基因频率比较
2.3 PCOS组和对照组CYP17各基因型间睾酮(T)水平比较 PCOS组CYP17 A2A2型T水平显著高于A1A2型和A1A1型(P<0.05),并且含A2等位基因组(突变组)的T水平(1.85±0.42) nmol/L显著高于不含A2等位基因组(无突变组)的T水平(1.41±0.55)nmol/L (P<0.05)。对照组CYP17各基因型之间的T比较,差异无统计学意义(P>0.05)。PCOS各基因型组的T值均高于对照组相应基因型组的T值，见表3。
表3PCOS和对照组各基因型间睾酮(T)水平(nmol/L)比较
注:※与A1A1组比较, P<0.05; △与A1A2组比较, P<0.05;a与对照组比较, P<0.05。
3 讨论 越来越多的证据证明PCOS具有一定的遗传学基础,而且PCOS临床表现的多样性提示它可能有多种基因参与其发病[7]，高雄激素血症是PCOS突出的临床特征，参与合成类固醇激素合成的酶活性的改变可能是PCOS高雄激素形成的原因之一。
P450c17a是卵巢和肾上腺雄激素合成的限速酶,具有17a-羟化酶和17,20-裂解酶双重活性,在雄激素的生物合成中起着重要的作用。Rosenfield等[8]用GnRH(促性腺激素释放激素)类似物nafarelin对高雄激素血症和PCOS妇女进行研究，结果发现高雄激素血症和PCOS患者肾上腺和卵巢对GnRH类似物敏感性增加，并且P450c17a酶活性增强与雄激素的过度合成和分泌有关。用ACTH(促肾上腺皮质激素)做肾上腺刺激试验和长效GnRH类似物triptorelin做卵巢刺激和抑制试验，结果表明大部分高雄激素血症的妇女卵巢和肾上腺P450c17a活性增高[9].而且，与非高雄激素血组对比，PCOS妇女卵泡膜细胞中P450c17a表达和活性增高。因此，P450c17a活性增高在PCOS高雄激素血症的发生中起重要作用。该酶由CYP17(17a-羟化酶/17,20-裂解酶)基因编码，CYP17基因的突变或变异将可能导致P450c17a酶活性的提高，从而增加卵巢或肾上腺雄激素的分泌。
CYP17基因位于染色体10q24.3，在其翻译位点上游-34bp处含有一个T→C碱基置换多态性位点。Dinamanti-Kandarakis等[1]对希腊50名PCOS患者和相同数量的对照妇女研究发现, T→C的碱基置换与高雄激素血症密切相关, PCOS患者A2A2基因型的血清T水平高于A1A2组和A1A2组，认为CYP17基因-34bp处T→C碱基置换引起该基因的表达异常，导致P450c17a酶活性增加，进而导致PCOS高雄激素血症的形成。Marszalek等[4]亦发现PCOS患者纯合C等位基因表现为血清睾酮水平的升高。但也有研究认为CYP17基因在-34bp处T→C的碱基置换与PCOS高雄激素血症无关[10]。Gharani等[10]研究发现, PCOS患者基因型分布与健康对照妇女无统计学差异, 与高雄激素血症亦无关联性 ......
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