有关流感病毒检测方法的研究
[摘要] 目的 比较多重逆转录聚合酶链反应(mRT-PCR)和胶体金法检测流感病毒的敏感性和特异性。方法 采用mRT-PCR和胶体金法检测经细胞培养和红细胞凝集抑制试验(HI)鉴定为A/H1、A/H3、B型流感病毒的鼻咽拭标本78份,阴性鼻咽拭标本40份,并对已稀释成101-105病毒半数感染量(TCID50)/0.1mL的3株H1、H3、B型流感病毒进行敏感性试验。结果 mRT-PCR对A型流感病毒的检测敏感性为44.8%,特异性为97.5%;对B型流感病毒检测敏感性为20.0%,特异性为100.0%。胶体金法对A型流感病毒检测敏感性为44.8%,特异性为100.0%;对B型流感病毒检测敏感性为5.0%,特异性为97.5%。结论 mRT-PCR和胶体金法的敏感性与特异性无差异;mRT-PCR和胶体金法均可用于人群流感鼻咽拭标本流感病毒快速检测,特别是聚集性暴发流感患者,建议采样时标本数要适当放大2-3倍。
[关键词] 流感病毒 分离 胶体金法
[中图分类号] R373.1+3[文献标识码] A[文章编号] 1005-0515(2011)-08-317-01
1 材料和方法
1.1 试验材料 标本来自某人民医院儿童医院分部和医院儿内科,从就诊流感样病例及肺炎病例(体温≥38℃)采集鼻咽拭子;如果局部有疑似流感暴发,由市、区疾控中心采集标本。标本采集后冷链12h内运送至实验室,24h内进行流感病毒分离培养和快速检测试验。24h内不能进行实验的咽拭标本即置-70℃低温冰箱保存待测。
1.2 实验方法
1.2.1 病毒分离培养与鉴定 采用20代内狗肾细胞(MDCK)分离培养。标本预处理:3mL标本加150μL“四抗”2-8℃冰箱过夜。将已长成单层的MDCK用含0.02mL/mL“四抗”基础培养基洗2次,接种150-300μL标本,34℃吸附1-2h后,吸弃标本液,加培养维持液(终浓度为5μg/mL胰酶、各50μL/mL“四抗”、0. 2%小牛血清白蛋白),置35℃、5%CO2培养箱培养,24h后逐日观察细胞病变,1周后对所有的细胞培养液用0.75%的人“O”型红细胞作微量血凝实验。血凝阳性培养液用国家流感中心统一下发的已知亚型血清作HI,鉴定所分离流感病毒的型别。
1.2.2 病毒半数感染量(TCID50)测定 用A/江苏北塘/122/2008 (H1)、A/江苏北塘/149/2008(H3)、B/江苏北塘/137/2008已知阳性标本进行10-1—10-7稀释,在已长成单层细胞的96孔微量细胞板上用MDCK病变法进行TCID50测定。各稀释度接种10孔,每孔接种0.1mL,接种方法同病毒分离,33-35℃、5% CO2一周判读TCID50结果。A/江苏北塘/122/2008(H1)为106.2TCID50/0.1mL、A/江苏北塘/149/2008 (H3)为106.5TCID50/0.1mL、B/江苏北塘/137/2008为106.5TCID50/0.1mL。
2 结果
2.1 mRT-PCR与胶体金法检测结果 mRT-PCR和胶体金法检测经传统细胞培养、HI鉴定已知A型流感病毒阳性的2008年鼻咽拭标本58份,已知B型流感病毒阳性鼻咽拭标本20份;已知流感病毒阴性鼻咽拭标本40份。mRT-PCR对A型流感病毒检测敏感性为是44.8%(26/58),特异性为97.5%(39/40);对B型流感病毒检测敏感性为20.0%(4/20),特异性为100.0%(40/40)。胶体金法对A型流感病毒检测敏感性为44.8%(26/58),特异性为100.0%(0/40);对B型流感病毒检测敏感性为5.0%(1/20),特异性为97.5%(39/40)。mRTPCR和胶体金法对A、B型流感病毒阳性检出率差异无统计学意义(P=0.8725、0.6794)。
2.2 mRT-PCR、胶体金法检测敏感性试验结果 对已稀释成10-10TCID50/0.1mL的已知A/江苏北塘/122/2008(H1)、A/江苏北塘/149/2008(H3)、B/江苏北塘/137/2008流感病毒分离阳性标本进行mRT-PCR、胶体金法检测敏感性试验。结果mRT-PCR的敏感性为103TCID50/0.1mL。胶体金法也为103TCID50/0.1mL,且3次结果相同。
3 讨论 本研究结果显示,mRT-PCR和胶体金法的病毒检出敏感性均为103TCID50/0.1mL。而在对疑似流感患者鼻咽拭子标本进行病毒分离时发现,约90%左右的标本在接种细胞后3-4d出现细胞病变,说明大部分鼻咽拭子标本中病毒含量在101-102TCID50/0.1mL左右。用PCR对cDNA进行检测的敏感性可达0.02-0.1TCID50/0.1mL,其检测的敏感性不容置疑,但由于流感病毒为RNA病毒,还涉及病毒RNA抽提过程中的损失以及如果标本不是立即进行逆转录至cDNA,可能存在病毒RNA降解等问题,因此我们准备进一步对鼻咽拭标本经MDCK细胞培养8-18h后采用mRT-PCR鉴定和其他方法的研究，克服传统培养分离和HI鉴定需要时间较长、需要流感病毒型特异性抗血清和PCR反应体系所需要的有效模板数问题,以提高检测的敏感性。
参考文献
[1] 姚栩,张彩云,陈智伟,等.应用PCR-RFLP技术进行乙型流感病毒鉴别的实验研究[J].中国卫生检验杂志,2007,17(11):1948-1951., 百拇医药(姜大栋 李叔霞 李琦)
[关键词] 流感病毒 分离 胶体金法
[中图分类号] R373.1+3[文献标识码] A[文章编号] 1005-0515(2011)-08-317-01
1 材料和方法
1.1 试验材料 标本来自某人民医院儿童医院分部和医院儿内科,从就诊流感样病例及肺炎病例(体温≥38℃)采集鼻咽拭子;如果局部有疑似流感暴发,由市、区疾控中心采集标本。标本采集后冷链12h内运送至实验室,24h内进行流感病毒分离培养和快速检测试验。24h内不能进行实验的咽拭标本即置-70℃低温冰箱保存待测。
1.2 实验方法
1.2.1 病毒分离培养与鉴定 采用20代内狗肾细胞(MDCK)分离培养。标本预处理:3mL标本加150μL“四抗”2-8℃冰箱过夜。将已长成单层的MDCK用含0.02mL/mL“四抗”基础培养基洗2次,接种150-300μL标本,34℃吸附1-2h后,吸弃标本液,加培养维持液(终浓度为5μg/mL胰酶、各50μL/mL“四抗”、0. 2%小牛血清白蛋白),置35℃、5%CO2培养箱培养,24h后逐日观察细胞病变,1周后对所有的细胞培养液用0.75%的人“O”型红细胞作微量血凝实验。血凝阳性培养液用国家流感中心统一下发的已知亚型血清作HI,鉴定所分离流感病毒的型别。
1.2.2 病毒半数感染量(TCID50)测定 用A/江苏北塘/122/2008 (H1)、A/江苏北塘/149/2008(H3)、B/江苏北塘/137/2008已知阳性标本进行10-1—10-7稀释,在已长成单层细胞的96孔微量细胞板上用MDCK病变法进行TCID50测定。各稀释度接种10孔,每孔接种0.1mL,接种方法同病毒分离,33-35℃、5% CO2一周判读TCID50结果。A/江苏北塘/122/2008(H1)为106.2TCID50/0.1mL、A/江苏北塘/149/2008 (H3)为106.5TCID50/0.1mL、B/江苏北塘/137/2008为106.5TCID50/0.1mL。
2 结果
2.1 mRT-PCR与胶体金法检测结果 mRT-PCR和胶体金法检测经传统细胞培养、HI鉴定已知A型流感病毒阳性的2008年鼻咽拭标本58份,已知B型流感病毒阳性鼻咽拭标本20份;已知流感病毒阴性鼻咽拭标本40份。mRT-PCR对A型流感病毒检测敏感性为是44.8%(26/58),特异性为97.5%(39/40);对B型流感病毒检测敏感性为20.0%(4/20),特异性为100.0%(40/40)。胶体金法对A型流感病毒检测敏感性为44.8%(26/58),特异性为100.0%(0/40);对B型流感病毒检测敏感性为5.0%(1/20),特异性为97.5%(39/40)。mRTPCR和胶体金法对A、B型流感病毒阳性检出率差异无统计学意义(P=0.8725、0.6794)。
2.2 mRT-PCR、胶体金法检测敏感性试验结果 对已稀释成10-10TCID50/0.1mL的已知A/江苏北塘/122/2008(H1)、A/江苏北塘/149/2008(H3)、B/江苏北塘/137/2008流感病毒分离阳性标本进行mRT-PCR、胶体金法检测敏感性试验。结果mRT-PCR的敏感性为103TCID50/0.1mL。胶体金法也为103TCID50/0.1mL,且3次结果相同。
3 讨论 本研究结果显示,mRT-PCR和胶体金法的病毒检出敏感性均为103TCID50/0.1mL。而在对疑似流感患者鼻咽拭子标本进行病毒分离时发现,约90%左右的标本在接种细胞后3-4d出现细胞病变,说明大部分鼻咽拭子标本中病毒含量在101-102TCID50/0.1mL左右。用PCR对cDNA进行检测的敏感性可达0.02-0.1TCID50/0.1mL,其检测的敏感性不容置疑,但由于流感病毒为RNA病毒,还涉及病毒RNA抽提过程中的损失以及如果标本不是立即进行逆转录至cDNA,可能存在病毒RNA降解等问题,因此我们准备进一步对鼻咽拭标本经MDCK细胞培养8-18h后采用mRT-PCR鉴定和其他方法的研究，克服传统培养分离和HI鉴定需要时间较长、需要流感病毒型特异性抗血清和PCR反应体系所需要的有效模板数问题,以提高检测的敏感性。
参考文献
[1] 姚栩,张彩云,陈智伟,等.应用PCR-RFLP技术进行乙型流感病毒鉴别的实验研究[J].中国卫生检验杂志,2007,17(11):1948-1951., 百拇医药(姜大栋 李叔霞 李琦)