联合用药对呼吸道合胞病毒的抑制作用
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[摘要] 目的 探讨联合用药对呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制作用。方法 将单磷酸阿糖腺苷(Ara-AMP)、病毒唑及柴胡分别稀释成不同的浓度，用细胞培养法观察药物的细胞毒性反应：采用Vero细胞先感染病毒2h后给药法观察细胞病变(CPE)和药物对RSV的抑制作用。结果 Ara-AMP、病毒唑及柴胡对Vero细胞的毒性剂量(TD)分别为0.25、0.2、2mg/ml；当Ara-AMP、病毒唑分别与柴胡联用时并未增加对细胞的毒性，而Ara-AMP与病毒唑联用时则对细胞的毒性增加；3种药物各自在Vero细胞上对RSV都有抑制作用.Ara-AMP和病毒唑的有效剂量均为25μg/ml，柴胡为125μg/ml。当3种药物配伍联合应用时，均可产生协同作用。结论 Ara-AMP、病毒唑及柴胡各自对RSV具有显著的抑制作用，它们的联合应用可产生显著协同作用，既可降低用药量，减少毒副反应，又可有效抑制RSV的感染。
[关键词] 呼吸道合胞病毒； 阿糖腺苷磷酸盐； 病毒唑； 柴胡
[中图分类号] R373.1[文献标识码] A[文章编号] 1005-0515(2011)-11-058-01
呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿下呼吸道感染的重要病原，严重危害婴幼儿的健康[1]。长期以来，临床上并无特效的抗RSV药，因此，筛选某些化学药物及抗生素制剂用于RSV感染的治疗有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料及来源 Vero细胞及RSV-Long株由衡阳市中心医院病毒室提供：RSV-Long株在Vero细胞上传代，病毒滴度为106TCID50/0.1ml，实验时用100TCID50/0.1ml。单磷酸阿糖腺苷(Ara-AMP)由广东省药物研究所制药厂生产，每支200mg；病毒唑注射液由武汉第二制药厂生产，每支100mg；柴胡注射液由河南淅川制药厂生产，每支2g。
1.2 药物的细胞毒性反应 将生长良好Vero细胞管分成不同剂量的9个实验组，即：Ara-AMP、病毒唑、柴胡、0.125m/ml的Ara-AMP分别加不同浓度的柴胡和病毒唑、0.1m/ml的病毒唑分别加不同浓度的Ara-AMP和柴胡、1mg/ml的柴胡分别加不同浓度的Ara-AMP和病毒唑，同时设正常细胞对照组。倾去营养液，加入不同稀释度的药物，每个稀释度2管，补足维持液至lml，35℃静置培养，与正常细胞相比较，每天观察细胞病变(CPE)，于第3天判定初次结果，第5天判定终结果。
1.3 药物对RSV的抑制作用 将Vero细胞管分成Ara-AMP、病毒唑、柴胡3个单项药物对RSV的抑制组，另设Ara-AMP加病毒唑、Ara-AMP加柴胡及病毒唑加柴胡联合用药3个组，共6组实验。弃去培养液，接种100TCID50的RSV0.1ml，随即将不同稀释度和不同配比的各种药物各0.1m1分别加入6个实验组的细胞管，每个稀释度2管，补足维持液至lml，同时设病毒和正常细胞对照组，于感染后第7天判定结果，当病毒对照的CPE达+++(75%)时，实验组的CPE不超过++的药物浓度判定为该药50%的抑制浓度(ID50)为有效剂量，以比较各种药物抑制RSV的强度。
1.4 药物抑制RSV的时机选择 将生长良好的Vero细胞接种100TCID50的RSV0.1ml，于感染的同时及感染后2、12、24、36h，分别加入各稀释度的不同药物，每稀释度2管，同时设病毒和细胞对照，补足维持液至lml，35℃培养，结果判断同1.3。
2 结果
2.1 药物的细胞毒性反应 (见表1)：单用剂量为0.5mg/ml的Ara-AMP时Vero细胞出现毒性反应，减至0.25mg/ml时，于第5天出现毒性，当剂量降至0.125mg/ml时，于第5天观察，未发现细胞毒性。单用病毒唑时，0.2mg/ml的浓度即可导致细胞出现毒性反应，而0.1mg/ml浓度时则无细胞毒性。柴胡以2mg/ml的浓度单用时出现细胞毒性，而lmg/ml的浓度时则无毒性反应。当0.125mg/ml的Ara-AMP和lmg/ml柴胡联用时，对细胞的毒性并未增加，而当它与0.1mg/ml的病毒唑联用时，对细胞的毒性增加，于第3天观察即出现细胞毒性。当0.1mg/ml病毒唑与lmg/ml的柴胡联用时.对细胞的毒性没有增加，到第5天时对细胞无毒性作用。
表1 药物的细胞毒性反应
2.2 药物对RSV的抑制作用 联合用药时Ara-AMP加病毒唑对RSV的抑制作用明显增强，如病毒唑l2.5g/ml加3.125μg/ml Ara-AMP的剂量就可对RSV发生作用[2]。这既可减少药物的用量，降低毒性反应，又可增强抑毒作用，是较理想的配比。这一特点在其他两组联合用药中也表现很明显。
2.3 药物抑制RSV的时机选择 当细胞被RSV100TCID50/0.1ml感染后，在感染的同时及感染后2、12h，向细胞管内分别加Ara-AMP125μg/ml、病毒唑100μg/ml及柴胡1000μg/ml时，均有明显的抑制作用，当感染后24h给药，抑制作用减弱，36h后给药则无效。本研究选择了RSV感染后2h给药的方法。
3 讨论 选择适当的制剂用于RSV感染的治疗是一项重要课题。但由于病毒依赖于宿主细胞进行复制的机制，许多抗病毒药物对宿主细胞也有毒性作用，因而可供临床选用的药物不多。为此，我们应用观察病毒致细胞病变作用(CPE)的方法，分别测定了Ara-AMP、病毒唑、柴胡及其联合应用对RSV的抑制效果。实验表明，3种药物在细胞上对RSV均有抑制作用。Ara-AMP和病毒唑的有效剂量均为25μg/ml ......
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