缺氧对血管生成素-2在人结肠癌细胞SW480中表达的影响(1)
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[摘要] 目的 探讨缺氧对血管生成素-2(Ang-2)在人结肠癌细胞SW480中表达的影响及其调节机制。方法 采用半定量RT-PCR检测常氧和缺氧状态(体积百分数95%N2，5%CO2；2小时，4小时，8小时)下体外培养人结肠癌细胞SW480Ang-2的mRNA表达水平。结果 与常氧组相比，Ang-2mRNA的表达在人结肠癌细胞SW480中随缺氧时间延长而逐渐上升(P<0.05),呈时间依赖性。结论 缺氧可以在基因转录水平上调人结肠癌细胞SW480Ang-2的表达,有利于肿瘤的生长和转移。
[关键词] 缺氧； 结肠癌； 血管生成素-2； RT-PCR
[中图分类号] R574.62 [文献标识码] A [文章编号] 1005-0515(2012)-01-046-02
血管生成素(Angiopoietin，Ang)是最近几年发现的血管内皮细胞特异性的酪氨酸激酶Tie-2受体的配体，包括Ang-1,2,3,和4，研究比较多的是Ang-2,它在多数实体肿瘤中如肝癌、肺癌、胃癌等呈过度表达。Ang-2的缺氧调节在内皮细胞和神经胶质瘤细胞等中有报道，但意见尚不完全统一，而在人结直肠癌中未见相关报道。本研究采用采用半定量RT-PCR检测缺氧状态下体外培养人结肠癌细胞SW480血管生成素Ang-2的mRNA表达，探讨缺氧对Ang-2基因表达的调节作用及其调节机制。
1 材料与方法
1.1 人结肠癌细胞SW480 人结肠癌细胞SW480由浙江大学医学院病理教研室馈赠,培养于含10%FBS(HyClone公司)的DMEM培养基(Gibco公司),0.25%胰蛋白酶(AMRESCO公司)消化传代。
1.2 细胞分组和缺氧处理 将在培养瓶内生长良好的SW480细胞分成缺氧2小时、4小时、8小时和常氧组四组，每五瓶为一组。待生长至对数生长期时，加入10%FBS的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱预培养12小时。然后置细胞于37℃、体积分数95%N2，5%CO2混合气体(杭州今工气体有限公司)的厌氧培养箱(浙江义乌冷冻机总厂)，分别按规定时间进行孵育。
1.3 RT-PCR检测Ang-2基因表达 取上述孵育的细胞按Trizlo试剂盒(BioBasicInc)说明一步法提取SW480细胞的总RNA,用紫外线分光光度计(SmartSpecTM3000)测定RNA纯度并定量。取总RNA行逆转录,逆转录体系及过程为:RNA2μg、0.05μ g/μloligo(dT)1810μl,混匀,70℃5min,冰上冷却3-5分钟,依次加入M-MLV5×ReactionBuffer5μl、10MmdATP、dGTP、dTTP、dCTP各1.25μl、RNasinI25U、M-MLV逆转录酶200U(均为Promega公司产品),补水至25μl,混匀,42℃60min，95℃10min,4℃保存。分别PCR扩增Ang-2和内参照GAPDH。特异性引物由上海生工合成。引物序列Ang-2:sense,5-GTCCACCTGAGGAACTGTCT-3,antisense,5-TTGTGACAGCACCGTCTGTA-3,扩增片断长度289bp;GAPDH:sense,5-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3,antisense,5-CCCTGTTGCTGTAGCCAAAT-3,扩增片断长度251bp。PCR扩增体系为10×TaqBuffer5μl、25mMMgCl25μl、10mMdNTP1μl、10pmol/μl上下游引物各1μl、cDNA0.6μl、Taq酶1μl(上海申能博彩)、去离子水补至终体积50μl。反应条件95℃5min，94℃50sec，56℃40sec，72℃30sec，共30个循环，最后72℃10min,4℃保存。取10μlPCR扩增产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后，应用凝胶扫描仪对电泳带进行吸光度扫描，并以GAPDH校正做相对量分析，数值以两者积分吸光度的比值表示。
1.4 统计学分析 吸光度以(x±S)表示,用单因素方差分析，用SPSS11.0forWindows统计软件包统计分析，P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果 缺氧诱导的体外培养：人结肠癌细胞SW480的Ang-2基因表达在四组人结肠癌细胞SW480样本中可检测到Ang-2mRNA表达。缺氧2小时、4小时、8小时组Ang-2mRNA表达分别高于常氧组(P<0.05)，缺氧8小时组高于缺氧2小时和4小时组(P<0.05)。缺氧处理后Ang-2mRNA表达上升，呈时间依赖性，F=48.973,P<0.001。(表1，图1)。
表1 RT-PCR分析缺氧SW480细胞Ang-2mRNA的表达(x±S，n=5)
*vsNormoxia,P<0.01;△vsHypoxia2hor4h,P<0.01。
图1 SW480细胞Ang-2mRNA表达的RT-PCR结果
1：泳道为常氧组；2、3、4：泳道为缺氧2小时、4小时、8小时组；
M为100bpDNAladder。
3 讨论 血管生成素(Angiopoietin，Ang)是近年来发现的血管内皮细胞特异性的血管生长调节因子，被认为是独立于VEGF受体途径的血管新生途径，任何一条都不能被另一条替代。血管生成素包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4，其配体为Tie-2。Ang-2在肿瘤血管新生中起重要作用[1]，在许多实体肿瘤如肝癌、肺癌、胃癌等的血管新生中，Ang-2表达于肿瘤边缘的血管重建区，参与肿瘤血管新生的起始及延续过程，影响肿瘤生长和转移。
缺氧是实质性肿瘤物理微环境的基本特征之一，是血管新生的一个强有力的刺激因素，与肿瘤的演进和转移有密切的关系。越来越多的证据表明缺氧是决定恶性肿瘤预后的重要因素[2]。缺氧不仅可以诱导肿瘤细胞对放疗及化疗的耐受性 ......
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