血管外膜脂肪组织分泌HIMF促进平滑肌细胞增殖(1)
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[关键词] 血管外膜； 脂肪组织； 分泌HIMF； 促进平滑肌细胞增殖
[中图分类号] R322.1+2 [文献标识码] B [文章编号] 1005-0515(2012)-02-023-01
越来越多的研究发现腹部脂肪组织参与了动脉粥样硬化(AS)的发生、发展[1]；向心性肥胖患者冠心病病率明显升高，血管外膜脂肪组织对血管功能可能有重要的调节作用，其能产生某些活性介质，促进动脉粥样硬化的进展[2]。HIMF(hypoxia-in duced mitogenic factor,HIMF)是2000年新发现的一个与炎症有密切关系的缺氧诱导有丝分裂因子，是一种分泌型蛋白，可能是一种信号分子，其分泌与白色脂肪组织，选择性激活的巨噬细胞密切相关[3-4]，具有刺激肺动脉平滑肌细胞增殖，收缩血管，促进血管新生等功能[5]，其与动脉粥样硬化是否有关，在血管外膜的分布表达情况如何尚为未知，本文利用动脉粥样硬化C57BL/6J小鼠，研究HIMF在动脉粥样硬化斑块的血管外膜表达情况。
1 材料与方法 (1)动物来源和主要试剂、仪器：C57BL/6J小鼠，20-30g，4周龄，购自北京大学实验动物中心。兔抗鼠HIMF(HIMFalpha)抗体(美国abcam公司)，免疫组化试剂盒(中山生物有限公司提供)；HRP山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术公司提供)，莱卡荧光倒置显微镜(德国LEIKA公司)，DAB显色试剂盒(北京中山生物有限公司)；RT-PCR试剂盒(TAKANA生物技术公司)，PCR引物为赛百盛生物技术公司生产。(2)实验操作及检测指标：C57BL/6J小鼠共12只，在实验条件下经1周的适应喂养。(3)分离腹主动脉血管外膜脂肪组织200毫克，按常规方法提取RNA，RT-PCR检测HIMFmRNA的表达情况，每个样本1μg的总RNA用于逆转录，总体积为20μl，β-actin作为表达的内参照。①HIMF：PCR的上游引物为5’-CAA TCC CAT GGC GTA TAA AAGCAT C-3’，PCR的下游引物为5’-TCA TTC TTA GGA CAG TTG GCA GCA，PCR产物为436bp。②β-actin：PCR的上游引物为5’-CTG CCG CAT CCT CTT CCT C-3，下游的引物为5'-CTG TCG CCT TCA CCG TTC C-3’，PCR产物为659bp。扩增条件：94℃，30s；56℃，30s；72℃，60s；扩增35个循环，最后，72℃延伸10分钟，1.5%琼脂糖凝胶电泳(90V,60min)，0.5mg/L的溴化乙啶染色20min，用Kodak EDAS120数字凝胶成像系统成像。(4)将小鼠肠系膜脂肪组织切下，连续横切，制备石蜡切片，取部分切片行HE染色，其余切片常规脱蜡后，行HIMF免疫组织化学染色，3%H2O2甲醇溶液孵育20分钟，3%羊血清封闭共30分钟，每张切片滴加1:500兔抗鼠HIMF第一抗体，对照组不加入一抗，加等量的PBS，4℃过夜，PBS清洗标本3次，加入1:1000HRP山羊抗兔IgG的二抗，孵育30分钟，PBS液清洗标本,DAB显色5分钟，苏木精复染，中性树胶封固，显微镜下观察各组HIMF蛋白的表达，棕色颗粒代表阳性表达。3H-TdR掺入试验测定平滑肌细胞增殖情况。平滑肌细胞(VSMCs)培养采用组织贴块法，取单层培养第4-8代平滑肌细胞，用含10%FBS的DMEM培养液调整细胞密度为1×105/ml；以每孔lml接种于24孔的培养板中，然后分别给以下各组药物刺激：①药物处理组，用终浓度分别为3×10-6mmol/L，9×10-6mmol/L，2.7×10-5mmol/L的HIMF刺激平滑肌细胞。②生理盐水对照组，用等量生理盐水刺激培养的平滑肌细胞，常规条件下培养24h，于收集细胞前6h加入3H-TdR，使3H-TdR的终浓度为2uCi/ml。细胞收获时，弃去培养液，D-Hank’s液洗一次，0.25%胰蛋白酶液消化后收集细胞，1000rpm离心5min，漂洗细胞3次，弃洗液，双蒸水破膜，经微孔滤膜收集细胞后，用10%三氯醋酸处理，滤膜烘干后，β液闪计数仪测量3H的放射活性[每分钟计数(cpm)]。
2 结果
2.1 如图1所示 C57BL/6J小鼠RT-PCR在肠系膜脂肪组织检测到HIMFmRNA表达。
图1 RT-PCR在外膜周围脂肪组织检测到HIMFmRNA表达(n=4)。
2.2 如图2所示 血管外膜周围脂肪组织免疫组化可见明显棕色颗粒，说明HIMF蛋白在血管外膜脂肪组织明显表达。
图2 HIMF 在肠系膜脂肪组织表达 (DAB显色×200)
脂肪组织内深棕色颗粒为HIMF 阳性表达。
2.3 3H-TdR掺入法检测平滑肌细胞增殖 如图3所示，HIMF各剂量组均能刺激平滑肌细胞增殖，与对照组比较，P<0.01，具有统计学差异。
图3 HIMF平滑肌增殖的影响
注：1为对照组，2为HIMF 3×10-6mmol/L组，3为HIMF 9×10-6mmol/L组，4为HIMF 2.7×10-5mmol/L组。与对照组比较，*P<0.01，与2组比较，*P<0.01；与3组比较，+P<0.05。
3 讨论 近年来研究表明，血管外膜脂肪不仅仅是一层包裹物，而对血管功能有重要的调节作用，Barandier C[6]等报道，血管外周脂肪组织对人平滑肌细胞增殖有刺激作用，而这种刺激作用是通过其分泌的蛋白生长因子实现的，他们从培养的小鼠脂肪细胞，年轻的和老年的大鼠，喂饲正常和高脂饮食3个月的大鼠以及瘦型的和肥胖的大鼠外周动脉脂肪组织制备条件培养基，观察其对平滑肌细胞增殖的影响，结果发现从分化的鼠脂肪细胞制备的条件培养基可显著刺激人平滑肌细胞增殖。Verlohren S[7]等研究发现，血管外膜周围的脂肪组织可能通过释放一些能减弱血管收缩的物质参与肠系膜小动脉的血管调节，外膜含有脂肪的血管对血管收缩药物刺激的收缩反应明显弱于外膜没有脂肪的血管，外膜含有脂肪的血管平滑肌细胞较外膜不含脂肪的血管平滑肌细胞更易去极化。Elvire Henrichot[2]等研究发现，血管周围的白色脂肪组织(pWAT)贴近血管壁尤其是趋向于产生动脉粥样硬化的位置，啮齿类动物在高脂饮食下pWAT显著增加，粒细胞和单核细胞的迁移分别主要由白细胞介素-8和单核细胞趋化蛋白介导，免疫组化和移植培养显示这些活性介质由pWAT产生，巨噬细胞和T细胞在pWAT和人动脉粥样硬化的主动脉外膜交界处的聚集反映了pWAT的趋化活性，作者认为pWAT可能促进肥胖相关的动脉粥样硬化 ......
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