瘦素对脂变肝细胞脂蛋白脂酶基因表达的影响(2)
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参见附件。
Keywords: Leptin, Human L-02 hepatocyte, TG, LPL,
脂蛋白脂酶 (lipoprotein lipase(LPL))活性或量的改变功能的失衡,不仅产生血脂紊乱(高甘油三酯血症、低HDL血症)与代谢综合征血脂异常有一致的表现,而且与代谢综合征、胰岛素抵抗及代谢失调众多表现如中心性肥胖、血糖调节失调、高血压、脂肪肝等密切相连。
本研究以离体人肝L-02细胞为研究对象,用游离脂肪酸制备肝细胞脂肪变性模型,用重组人瘦素作为处理因素,通过油红O染色观察细胞形态和细胞内脂滴的形成情况,高效液相色谱法检测细胞内甘油三酯的含量,半定量RT-PCR法检测脂蛋白脂酶的mRNA表达,初步探讨瘦素对脂肪肝甘油三酯的含量及脂蛋白脂肪酶基因表达的影响,为脂肪肝防治提供依据。
材料与方法
1 实验材料
人肝L-02细胞株购自武汉大学典型物保藏中心。本实验所用细胞株为第10—13代。医用脂肪乳注射液 ,华瑞制药有限公司。重组人瘦素,美国Sigma公司。吉非罗齐,意大利Sigma-TauS.P.A公司。即用PCR扩增试剂盒 ,上海生物工程公司。LPL和GAPDH引物,上海生物工程公司。
2 实验方法
2.1 细胞培养、冻存、复苏
2.1.1细胞培养:人肝L-02细胞在含体积分数10%的灭活胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中,置37℃、体积分数5% CO2、饱和湿度的孵箱内培养。用培养液调细胞密度至1×106个/ml,24小时后换入含0.1%胎牛血清的1640培养液中,使细胞静止24小时后,再做相应的处理。
2.1.2细胞冻存:取对数生长期的细胞,收集前24小时换液一次。用0.25%的胰蛋白酶与室温消化细胞,待细胞收缩、部分脱壁时加入含10%胎牛血清的RPMI-1640终止,收集细胞悬液,离心(1000rpm,5min),弃上清,细胞沉淀物中加入冻存培养液(10%DMSO的胎牛血清培养基),冻存液中细胞最终密度为5×106/ml,分装于冻存管中。将冻存液直立放置于塑料盒中周围固定,放入4℃冰箱30分钟,再放入-20℃冰箱,经过2h以后,再转入-80℃冰箱,过夜后取出冻存管移入液氮容器中。
2.1.3 细胞复苏:将含冻存细胞的冻存管迅速置于37℃温水中,并不时搅动令其尽快融化,约一分钟后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球檫拭冻存管外壁拿入超镜台内,用吸管吸出细胞悬液,注入离心管并加入10ml培养液,混合后1000 rpm,离心5分钟,除去上清液,再重复用培养液洗涤一次。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞,台盼蓝染色计数,成活率为90%以上。次日观察,换液一次,继续培养。
2.2 肝细胞脂肪变性模型的制备
人肝L-02细胞达1×106个/ml时用完全培养基重新悬浮,并以1:3的比例传代,取对数生长期细胞,更换新鲜培养液后,用含体积分数10%医用脂肪乳注射液和10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基孵育人肝L-02细胞24小时,出现细胞内脂滴或泡沫样物沉积,则制成肝细胞脂肪变性模型。将所得细胞改置于含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,使其静止24小时后,再做相应的处理。
2.3 实验分组(表1)
2.4油红O染色
采用Lillie氏油红O染色法:将细胞培养于预先放有无菌盖玻片的6孔培养板,处理结束后,用PBS冲洗盖玻片3次,每次5分钟,50%异丙醇固定1分钟,油红O染色液染色10分钟,蒸馏水冲洗3次,每次1分钟,苏木素染色5分钟,蒸馏水冲洗3次,0.1%盐酸分色2秒后蒸馏水冲洗,氨水浸泡返蓝,明胶封片,HPIAS-1000型图像分析系统收集图像。
2.5 HPLC测量细胞内甘油三酯含量
2.5.1标准溶液和内标溶液的配置 精密量取色标纯甘油适量,20%的异丙醇-水溶液稀释,制备浓度为0.565,1.129,2.259,3.388,4.517 mmol/L的标准溶液(相当于50-400mg/dL的三油酸甘油酯),用于总甘油测定; 制备浓度为0.0565,0.1129, 0.2259, 0.3388, 0.4517 mmol/L的标准溶液(相当于5-40mg/dL的三油酸甘油酯), 用于游离甘油测定。称取色标纯1,2-丙二醇适量,用水稀释成0.25 mmol/L的内标液用于细胞内总甘油和游离甘油测定。
2.5.2细胞内甘油三酯的测定 参照文献[5,6]方法,待细胞处理结束后,弃去培养基,PBS洗3遍,收集细胞后,冰浴中超声破碎细胞。采用C-18柱,柱温4℃,流速1ml/min, 230nm 紫外光检测,以峰面积定量,内标校准,计算细胞内游离甘油三酯与总甘油三酯的比值,以mmol/g细胞蛋白为单位。
2.6 RT-PCR检测细胞中脂蛋白脂酶mRNA水平
2.6.1 总RNA提取 处理因素作用后,吸弃50mL培养瓶中上清液,用PBS洗涤每组细胞各3次。每瓶加入1ml Trizol,待细胞溶解后,移入1%DEPC处理过的1.5ml EP管中。避光加入氯仿200μL,振荡混匀,室温下静置5分钟。4℃12000转/分离心10分钟。可见EP管中液体分为三层:无色的水相,中间层和红色的有机相,RNA主要在水相(上层)。 吸取上层水相转移至另一离心管中。 加入异丙醇500μL振荡混匀,常温下静置15分钟。 4℃ 12000转/分,离心10分钟。离心后可见RNA的白色粉末样物贴于管底管壁。 去上清,加入75%冰乙醇1ml,充分洗涤沉淀,振荡摇匀。 4℃ 5000转/分,离心5分钟去上清,置EP管于通风厨中干燥RNA 10分钟。 将沉淀溶于20μL DEPC水。分装,-86℃保存备用。
2.6.2总RNA定量 取2μL总RNA样本,在1%琼脂糖凝胶(含0.5%ng/mlEB)上进行电泳,电泳缓冲液为0.5×TBE,电压为5V/cm,电泳时间为15分钟。电泳后在紫外透射仪上观察,如果RNA无降解,可见28S,18S和5S三条清晰的橘黄色带,28S与18S的亮度之比约为2:1。取无明显降解的总RNA样本1μL, 稀释1000倍,在紫外分光光度计上测定其OD260nm值和OD280nm值,两者比值约为2.0,按1 OD260nm相当于1ug/μLRNA计算RNA样本的含量 ......
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