烟草浸提液对人牙周膜细胞增殖的影响
 |
| 第1页 |
参见附件。
烟草浸提液( smokeless tobacco extract ,ST)含烟草主要成分,有多重生物学毒性[3]，不仅会影响全身神经系统和骨骼的发育，还可抑制体外培养的牙周膜细胞(periodontal ligament cells, PDLC)的增殖、粘附、ALP活性及其趋化性[4]，从而导致牙周膜修复功能下降，牙周病变加重，治疗效果差。本文通过研究不同浓度烟草浸提液对PDLC增殖的影响，进一步探讨吸烟对牙周炎的影响及其作用机制。
1 材料和方法
1.1 材料:标准胎牛血清(PAA，奥地利)、DMEM培养基(Gibco，美国)、胰蛋白酶(Gibco，美国)、DMSO(Sigma，美国)、MTT(Sigma)、烟草(中华牌成品盒装香烟)、青霉素、链霉素。
1.2 方法。含烟草浸提液培养液的配制[5]：称取5g盒装香烟的烟丝,浸入0.1L的双蒸水中,37℃孵箱中放置48h,过滤除菌,将此液浓度定为50g/L,用含1%标准胎牛血清(FBS)的DMEM培养液配制含ST的培养液,ST浓度分别为1.6g/L、3.1g/L、6.2g/L、12.5g/L、25g/L和50g/L6个浓度组。
1.2.1 组织块法培养牙周膜细胞[6]。口腔外科门诊选取青少年正畸拔除的健康前磨牙，刮取根中1/3的牙周膜，接种于装有少量含有20%FBS的DMEM培养液的35mm一次性无菌培养皿中，放入CO2培养箱内培养，待组织块贴壁后每3天换一次培养液常规培养。
1.2.2 细胞传代培养。当细胞汇合达瓶底80～90%，即可进行传代。传代时弃去旧的培养液，加入0.25%胰蛋白酶消化，吸管吹打成细胞悬液，以1：2将细胞转至新的培养瓶中，加足培养液标准条件下继续培养。
1.2.3 免疫组织化学SP法进行牙周膜细胞的鉴定。按照SP试剂盒说明书操作。PBS冲洗细胞爬片三次,每次3min。0.3%TritonX-100室温下处理10min。高温下，枸橼酸盐抗原修复液修复细胞抗原10min。每张爬片加50?L过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次,每次3min。除去PBS液，每张爬片加50μL正常非免疫动物血清(试剂B)，室温下孵育10min。除去血清，每张爬片加50μL的第一抗体,室温下孵育60min。PBS冲洗3次,每次3～5分钟。除去PBS液,每张爬片加50μL生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次,每次3min。除去PBS液,每张爬片加50μL链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次,每次3min。除去PBS液,每张爬片加100μL新鲜配置的DAB溶液,显微镜下观察3～10min。自来水冲洗，苏木素复染，PBS冲洗返蓝。梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜观察并摄片。
1.2.4 烟草浸提液对PDLC增殖的影响。取第5代人PDLC，以1×105/ml接种于96孔板内，每孔100ul，CO2孵箱内标准环境下培养24h，使其贴壁，更换含1%FBS的DMEM培养液培养24h，200ul/孔，使细胞相对同步化。实验分为烟草浸提液组和对照组，每组设置6种浓度，每种浓度5孔。①烟草浸提液组：浓度分别为1.6g/L、3.1g/L、6.2g/L、12.5g/L、25g/L和50g/L。②对照组：只加入含1%FBS的DMEM培养液200ul。
培养3天后，每孔加入MTT溶液20ul培养4h，弃去孔内液体，每孔分别加入DMSO150ul，震荡10min，酶标仪490nm波长下测定每孔光密度值(OD)，用统计软件SPSSV14.0进行方差分析。
2 结果
2.1 人正常PDLC的原代培养、扩增约10~15天后镜下观察组织块周围有细胞游出，细胞呈长梭形，核为椭圆形，体积大，大部分为单个细胞核，胞浆透明。紧靠组织块周围的细胞密度较高，紧密排列在一起，向组织块外围呈放射状扩展，最外围细胞密度低，散在存在。20~25天后，细胞长满培养皿底壁的80%，彼此连接成片，形态规则，细胞之间界限不清，排列具有一定方向性，呈漩涡状。此时将细胞传代至培养瓶中。
2.2 传代后的细胞生长状态良好，第二天大部分细胞已贴壁，由类圆形舒展为长梭形。5~7天后，细胞面积已占瓶底面积的80%~90%，细胞彼此连接成片，呈漩涡状排列，界限不清，胞核已不如原代时明显。2～6代细胞外观基本相同，至第7代部分细胞形态不规则，大小不等，分裂增殖较前6代细胞缓慢，瓶底部分区域细胞已不是单层生长，状态欠佳。
2.3 MTT比色实验结果。
50g/l的烟草浸提液与对照组相比P>0.05；其余浓度的与对照组相比较均P<0.05；12.5g/l烟草浸提液与其他浓度相比，显示出最强的抑制增殖作用。(P<0.01)。
3 讨论
牙周膜细胞是牙周膜中的主要细胞成分,具有趋化、粘附、增殖、生物合成等多种生物学功能。PDLC具有干细胞特性，能够自我更新，多向分化，是牙周组织再生的细胞来源[7]。PDLC一生中不断形成新的主纤维、牙骨质，并改建牙槽骨，这种功能对牙周组织的修复十分重要，是牙周炎治疗后形成牙龈与牙根面之间新附着的主要细胞来源。牙周膜细胞的特性和所具有的功能决定了它在牙周组织再生中的重要性。
吸烟是牙周病尤其是重度牙周炎的高危因素。研究表明,吸烟可从多个方面影响牙周病的发生、发展及预后。本研究利用体外培养的正常人牙周膜成纤维细胞为实验对象,通过MTT方法测定ST对细胞增殖的影响。结果表明,ST抑制体外培养人牙周膜成纤维细胞的增殖，12.5g/l的烟草浸提液显示出最强的抑制增殖作用 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(3087kb)。